甘油脱水酶再激活酶的克隆表达及活性鉴定

运用PCR技术从克雷伯氏菌的基因组中分别扩增得到了编码甘油脱水酶再激活酶α、β两个亚基的基因gdrA、gdrB。将gdrA、gdrB克隆至pMD-18T载体上,构建克隆载体pMD-gdrAB。经测序正确后,将gdrAB亚克隆至表达载体pET-28a( )上构建表达质粒pET-28gdrAB。利用双抗生素筛选法,将pET-28gdrAB与连有甘油脱水酶基因的表达载体pET-32gldABC在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中共表达,鉴定了甘油脱水酶再激活酶的活性。     

甘油脱水酶和二醇脱水酶β亚基生物信息学分析

依赖辅酶B12的甘油脱水酶和二醇脱水酶是同工酶。它们不仅氨基酸序列和蛋白质折叠方式非常相似,而且有着相同的催化机制。该文在同一菌株中将编码甘油脱水酶β亚基基因和编码二醇脱水酶β亚基基因片段分别克隆至T载体,从而获得两段核苷酸片段序列,将pddB序列提交Genbank数据库,获登陆号为DQ483052。同时结合PDB数据库中甘油脱水酶和二醇脱水酶的晶体结构,该文用生物信息学方法对所测序列进行了初步分析,并对两种同工酶的β亚基对脱水酶与辅酶的亲和力进行了比较。     

甘油脱水酶再激活因子的克隆表达及活性鉴定

运用PCR技术从克雷伯氏菌的基因组中分别扩增得到了编码甘油脱水酶再激活酶α、β两个亚基的基因gdrA、gdrB。将gdrA、gdrB克隆至Pmd-18T载体上,构建克隆载体Pmd-gdrAB。经测序正确后,将gdrAB亚克隆至表达载体Pet-28a(+)上构建表达质粒Pet-28gdrAB。利用双抗生素筛选法,将Pet-28gdrAB与连有甘油脱水酶基因的表达载体Pet-32gldABC在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中共表达,鉴定了甘油脱水酶再激活酶的活性。     

依赖辅酶B12的甘油脱水酶生物信息学分析

用生物信息学的方法对依赖辅酶B_(12)型甘油脱水酶的各个亚基结构进行了分析,并对其功能进行了探讨。通过对底物未结合时与底物结合后的酶分子构象变化进行分析,探讨了底物的结合对各个亚基的影响。