大肠杆菌Na+/H+反向运输体A基因的克隆及序列分析*

为研究细菌的耐盐机理 ,根据细菌中存在的Na⁺/H⁺反向运输体 (nhaA)的基因序列 ,采用PCR扩增的方法 ,从大肠杆菌 (Escherichiacoli)DH5α中克隆获得了11kb的DNA片段 ,经过核酸序列分析 ,发现基因片段包含了nhaA基因完整的读码框架。采用序列同源性分析方法 ,结果显示nhaA基因在多种细菌中均存在 ,表明nhaA基因是细菌中普遍存在的一种能够反向运输Na^{+相似文献}   

提高农杆菌基因转化率方法的研究

通过甘蓝型油菜带柄子叶转化过程中转化受体是否进行预培处理、转化前菌液的对数浓度确定以及合适的再生筛选体系的摸索,研究了提高农杆菌基因转化效率的方法。试验结果表明：转化受体经过MD培养基3d的预培处理,用处于对数生长期OD600为0．6～0．8的菌液稀释至所需浸染浓度,浸染所需时间共培后,转入降低卡那霉素浓度的初筛分化培养基中,再经过后期较高浓度的卡那霉素继代筛选培养,大大提高了转化后卡那霉素抗性绿苗的得率。此研究不仅优化了油菜的转化体系和提高了油菜的转化效率,而且为农杆菌转化其它不同物种的受体材料提供了可指导的借鉴。     

抗冻蛋白研究进展(英文)

很多越冬的生物会产生抗冻蛋白,这些抗冻蛋白能够吸附到冰晶的表面改变冰晶形态并抑制冰晶的生长.抗冻蛋白在很多生物体内都被发现,不同的抗冻蛋白结构差异非常大.目前的一些研究揭示了几种抗冻蛋白的结构,并提出了抗冻蛋白与冰晶的结合模型,但是还没有一种机制能解释所有抗冻蛋白的作用机理.抗冻蛋白能被广泛的应用到农业、水产业和低温储藏器官、组织和细胞,利用转基因技术提高植物的抗冻性具有重要应用价值.而抗冻蛋白基因的表达调控则有待进一步阐明.     

鉴定免疫细胞中DNA疫苗结合蛋白

为研究DNA疫苗从细胞质到细胞核的过程,对免疫细胞中DNA疫苗的结合蛋白进行初步鉴定。 提取小鼠脾脏免疫细胞的细胞质蛋白,将细胞质蛋白分别与 DNA 疫苗 pVAX-OVA 和空载体 pVAX 共孵育,孵育后首先由琼脂糖凝胶电泳分离与DNA结合的蛋白,然后通过SDS-PAGE进行分离和纯化,最后应用质谱技术分析其蛋白组分。质谱结果初步鉴定了免疫细胞中pVAX-OVA 结合的蛋白有IQ motif containing F4 等。免疫细胞中与 pVAX 结合的蛋白有Foxl2,SUV420H2 和 gamma actin 等。Foxl2具有核定位序列,DNA结合区域和与核转运蛋白相互作用的特点,可能对DNA疫苗的进入具有促进作用。这些蛋白质是否可以影响DNA疫苗有效进入细胞核进行基因表达需要进一步研究。     

新疆3种藜科盐生植物NHX基因的克隆与序列分析比较

从新疆野生植物盐角草(Salicornia europaea)、盐爪爪(Kalidium foliatum)和盐穗木(Halostachys caspica)中分别克隆了约1.7kb的NHX基因cDNA片段,此片段均包含了NHX完整基因,三者之间有较高的同源性,盐角草NHX基因与盐爪爪NHX基因同源性达92.81%,盐角草与盐穗木同源性达92.19%,盐爪爪与盐穗木同源性达97.66%.它们与其它几种藜科盐生植物如滨藜、碱蓬、灰绿藜的NHX基因同源性也很高,达到80%以上,与拟南芥同源性也达到86%.此基因在植物尤其是藜科盐生植物中高度保守,其编码的功能性蛋白可能在影响植物耐盐中起作用.     

在胡杨NHX基因内发现细菌转座子IS10 L的存在

采用RTPCR扩增的方法,从新疆不同地区的野生植物胡杨中分别克隆获得1kb和2.3kb的cDNA片段,测序和序列分析表明这两个基因片段均包含NHX基因的部分读码框架,分别命名为PtNHX和PwNHX。PtNHX序列同源性分析结果显示胡杨NHX基因与滨藜NHX基因同源性高达98%,与碱蓬同源性达到86%,与拟南芥同源性为84%,与水稻同源性为80%,表明它是植物中高度保守的一种基因,同时说明野生植物胡杨中也存在与拟南芥相似的植物耐盐相关基因。PwNHX序列分析表明,该基因内部含有一种转座酶的读码框,大小约1350bp,与已发表的Shigella flexneri.转座子Tn10基因序列(AF162223)同源性为99%。NHX基因的蛋白产物在植物的耐盐性方面起着重要的作用。推测PwNHX由于插入转座酶读码框可能会导致该基因的功能丧失。胡杨生存于盐碱地,其体内可能存在另一些机制使胡杨具有抗盐碱的能力。对于这些机制的研究可能有助于进一步了解植物的抗盐机制。利用PwNHX基因内的转座子作基因标签,可进一步研究胡杨的其它基因,从而有可能揭示胡杨叶子发育的变态过程、耐盐碱等性状。     

胡杨Na+/H+反向运输载体(PeNHX2)基因的克隆与序列分析

植物液泡膜上Na /H 反向运输载体(Na /H antiporterNHX)已被证明在盐胁迫中发挥关键作用,该研究旨在从胡杨中克隆获得耐盐相关的的完整cDNA序列,为进一步比较胡杨的耐盐基因的差异,探讨胡杨的耐盐分子机理奠定了基础,并为通过转基因手段提高木本植物的耐盐能力提供侯选基因。根据已发表NHX的同源基因序列,采用特异性引物扩增核心片段,并结合5’与3’RACE技术,成功地从胡杨(populus euphratica)克隆获得PeNHX2,其cDNA全长1638bp。测序和序列分析结果表明该基因与已发表毛白杨(Populus tomentosa)PtNHX基因在核酸水平及蛋白质水平上同源性均达到最高,依次为90.6%和88.25%。利用DNAMAN软件进一步分析得知,该基因与新疆盐生植物中所克隆获得的的犁苞滨藜(Atriplex dimorphostegia)AdNHX1、灰绿藜(Chenopodium glaucum)CgNHX1、盐爪爪(Kalidium foliatum)KfNHX同源性也较高,核酸水平上依次为75.1%、74.8%、74.3%,蛋白质水平依次为78.3%、79.0%、78.3%。PeNHX2与NCBI已注册的部分PeNHX1序列,在核酸或蛋白质水平同源性(72.34%和73.72%)均较低,分析它们可能同属于胡杨NHX基因家族,相关生物学功能有待于进一步研究。     

大肠杆菌nhaB基因的克隆及序列分析

采用PCR扩增的方法,从大肠杆菌DH5α中克隆获得了1.5kb的Na^ /H^ 反向运输体DNA片段,经过测序和序列分析,发现该基因片段包含了nhaB基因完事的读码框架。采用DNA序列同源性分析方法,结果显示大肠杆菌DH5α nhaB基因与E.-coliK12 nhaB基因同源性高达99%,与E.coli O157:H7和Shigella flexneri的同源性均为98%,与Salmonella enterica的同源性为79%,表明nhaB基因在细菌中是普遍存在的一种Na^ /H^ 反向运输体基因。nhaB基因与大肠杆菌的耐盐性有着密切的关系,编码的功能性蛋白可能在改良生物耐盐性方面具有重要意义。     

拟南芥AtNHX2启动子的克隆及表达模式分析(英)

AtNHX2基因是拟南芥NHX基因家族的一员,编码了一种液泡膜中的Na⁺/H⁺反向运输体并对拟南芥的耐盐能力起着重要的作用.采用PCR扩增的方法克隆了拟南芥AtNHX2基因启始密码子上游约2.8 kb的DNA片段,并将其克隆到植物表达载体pCAMBIA1301-1中,通过基因枪轰击洋葱表皮瞬时表达的方法,初步检测启动子的活性.将重组质粒pCAMBIA1301-1/AtNHX2 promoter转化拟南芥并筛选纯合子.AtNHX2 promoter-GUS分析显示AtNHX2在所有的组织中均有表达,包括根尖.在保卫细胞中检测到了强烈的GUS表达,这一结果表明,AtNHX2对特殊细胞的pH调控和K⁺自身稳定方面起着重要的作用.AtNHX2启动子的活性可被NaCl抑制,并且抑制的强度和NaCl的浓度成正相关. 300 mmol/L KCl处理可增强启动子的活性,说明NaCl和KCl是在转录水平上调控AtNHX2的表达.在老叶中GUS活性比在新叶中GUS活性强,这说明了AtNHX2优先将有毒的离子积累在老叶中,从而有利于植物的正常发育.在根毛细胞中也观测到了强烈的GUS活性,这就暗示了AtNHX2在扩大的液泡中储存Na⁺.     

单引物方法克隆盐角草orf25基因

采用单引物RT-PCR扩增的方法,从新疆野生植物盐角草（Salicornia europaea）中克隆获得了1.7kb的cDNA片段,经过测序和序列分析,发现基因片段包含了orf25基因完整的读码框架。采用序列同源性分析方法,结果显示新疆盐角草orf25基因与甜菜线粒体同源性高达98%,与烟草线粒体同源性达到95%,与小麦同源性为92%,与玉米同源性为88%,表明orf25基因在植物中是高度保守的一种基因,同时说明野生植物盐角草中也存在与农作物相似的雄性不育相关基因,orf25基因编码的功能性蛋白可能在影响植物雄性不育改良作物品种方面具有重要的意义。