脂滴与其他细胞器互作调控脂稳态的分子机制

随着影像技术的发展,越来越多的研究表明细胞器之间存在广泛的直接相互作用,其主要功能是参与物质运输、细胞器新生与生长、细胞器分裂与融合等.细胞器间的互作主要由定位于这些膜器表面的蛋白质分子相互作用介导,磷脂也在其中发挥作用.脂滴作为储存中性脂的细胞器,是细胞内脂质代谢的中心,同时对机体脂稳态的维持起着至关重要的作用.从脂...     

小鼠Cidea蛋白N端缺失异构体的鉴定和研究

Cidea蛋白调节脂肪代谢,在机体能量平衡过程中起重要作用,在转录和翻译后水平受到严格调控,但在翻译水平的调节还不清楚．通过对CIDEA基因敲除小鼠模型研究,鉴定了小鼠棕色脂肪组织内源性表达Cidea蛋白N端缺失异构体mCidea-22．定点突变等研究表明其产生机制为选择性起始翻译．并且,在异位表达时,N端缺失异构体和全长异构体的比例呈现细胞系特异性．此外,蛋白质稳定性实验表明mCidea-22半衰期很短．亚细胞定位研究显示mCidea-22是内质网和脂滴定位蛋白．为深入理解Cidea蛋白的功能和精细调节提供了新的思路和方向．     

Fsp27通过抑制HSL的脂滴定位调控脂肪水解

Fsp27是CIDE蛋白家族的一员,其特异性地在脂肪组织中表达并定位于脂滴表面,促进脂滴融合增大和脂肪积累.Fsp27敲除小鼠表现出胰岛素敏感性增强,有较高的能量消耗,并且可以抵抗高脂食物引起的肥胖,但Fsp27是否直接参与脂肪水解的调控过程并不清楚.本研究发现,在3T3-L1脂肪细胞中基因沉默Fsp27导致脂肪水解速率上升,并且这种上升是由激素敏感型脂肪酶(HSL)所介导.进一步在3T3-L1前脂肪细胞中过表达Fsp27以及HSL,对其定位的观察结果显示,Fsp27可以显著地抑制HSL在脂滴表面的定位.本研究表明,在脂肪组织中,Fsp27能够直接影响HSL在脂滴表面的定位,进而抑制脂肪水解速率,导致脂类积累.     

小鼠FSP27基因沉默的前脂肪细胞系的建立

用含有针对小鼠FSP27基因的siRNA慢病毒,感染小鼠前脂肪细胞系3T3-L1,建立小鼠FSP27基因沉默的前脂肪细胞系,为进一步研究该基因在脂肪细胞分化和脂肪代谢过程中的作用提供实验材料.根据小鼠FSP27基因设计双链siRNA,克隆至pSilencer2.1-U6质粒,形成含U6-siRNAbox的重组质粒.在293T细胞中检测siRNA沉默FSP27基因的效率,结果显示,siRNA可以高效地抑制外源小鼠FSP27的表达.将U6-siRNAbox重组到慢病毒载体FG12上,并将慢病毒载体与其他辅助载体用磷酸钙法转入293T细胞,包装成慢病毒.收集、浓缩、纯化病毒上清并用来感染靶细胞3T3-L1,检测感染效率和内源蛋白表达量的变化.结果显示,该siRNA可以高效地抑制内源小鼠FSP27的表达,并且siRNA插入基因组中,形成稳定表达.至此,小鼠FSP27基因沉默的前脂肪细胞系成功建立,为研究FSP27基因的功能提供了研究基础.     

转异源chi基因的Bt工程菌株的生防潜力评价

【目的】构建增强抑制真菌能力兼杀虫的苏云金芽胞杆菌多功能生防菌株。【方法】将含有组成型高效表达启动子、地衣芽胞杆菌chi MY基因的重组质粒p DM,转化进杀虫活性高且有一定抑菌活性的Bt519-1菌株。酶谱分析方法确认Bt519(p DM)组成型异源表达几丁质酶。室内测定工程菌株抑菌谱,计算抑菌效率,确定最敏感的植物病原真菌,进行植物盆栽病害防治的应用潜力评价。将不同浓度的Bt粗酶液灌入甜椒幼苗根部,12 h后接种辣椒疫霉孢子液,接种2 d后开始观察,记录发病株数。自7 d起调查植株发病情况统计并分析防治效果。【结果】SDS-PAGE及酶谱分析证明,Bt519(p DM)能够特异表达68 k D蛋白,该蛋白为异源几丁质酶Chi MY。抑菌谱测定证明,工程菌抑制效率达到90%以上的有5种真菌,其中最明显的是辣椒疫霉。盆栽实验证明,Bt519(p DM)7 d的防效为73.2%。工程菌株对棉铃虫的半致死浓度(LC50)为121.26 mg/L。【结论】Bt519(p DM)是一株有应用潜力的生防菌株。     

组成型表达chi基因的Bt工程菌株构建及其特性

【目的】通过构建能够组成型高效表达几丁质酶的苏云金芽胞杆菌工程菌株,以提高其抑真菌活性。【方法】首先通过PCR扩增获得Bti75菌株chiB全长及系列缺失启动子片段,与本室构建的启动子探测型载体pCB连接,转化Bti75菌株,通过β-半乳糖苷酶活性检测及β-半乳糖苷酶mRNA的Real time-PCR检测,确定了一段长度为190 bp的组成型高效表达启动子。将这一启动子分别与Bti75自身几丁质酶基因chiA以及地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)的几丁质酶基因chiMY连接构建了组成型高效表达的工程菌株Bti75(pDA)和Bti75(pDM)。应用几丁质酶酶活检测、SDS-PAGE及酶谱分析检测了工程菌几丁质酶的表达情况。最后,通过检测工程菌发酵粗酶液对真菌孢子萌发和菌丝生长的影响,评估了工程菌对3种植物病原真菌的抗真菌活性。【结果】在没有诱导物存在的情况下,Bti75(pBPΔ7)菌株表达的β-半乳糖苷酶酶活和β-半乳糖苷酶mRNA的转录量分别是Bti75(pBP)菌株的7倍和2.5倍左右。在没有几丁质诱导的情况下,与野生株Bti75相比,工程菌株Bti75(pDA)和Bti75(pDM)的几丁质酶活性均提高了3.5倍左右。SDS-PAGE及酶谱分析证明目的几丁质酶在非诱导条件下达到组成型高效表达,抑真菌实验显示工程菌Bti75(pDA)和Bti75(pDM)抑制3种植物病原真菌的活性明显提高。【结论】发现190 bp的缺失启动子能够组成型高效表达不同来源的几丁质酶,无需诱导物的诱导,工程菌株就能展现良好的抗真菌能力。