人肺腺癌细胞A—549和正常细胞HBE的蛋白质组差异分析

为了研究人肺腺癌细胞A 5 49和正常细胞HBE的蛋白质组差异 ,用固相pH梯度双向凝胶电泳分离人肺腺癌细胞系A 5 49和正常细胞HBE的总蛋白质 ,银染显色 ,PDQuest 2 DE软件分析 ,对部分差异蛋白质点进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI TOF MS)测定其胶内酶解后的肽质指纹图谱 ,用PeptIdent软件查询SWISS PROT数据库。结果获得了分辨率和重复性均较好的双向电泳银染图谱 ,图象分析探测到A 5 492 DE图谱的平均蛋白质点数为 (890± 38)个 ,HBE的平均蛋白质点数为 (75 7± 2 7)个 ,不同胶间蛋白质点的位置偏差在IEF方向为 (2 .85± 0 .48)mm ,在SDS PAGE方向为 (2 .6 9± 0 .37)mm。差异表达分析发现A 5 49和HBE图谱有5 35个蛋白质点相互匹配 ,其中A 5 49有 35 5个未被匹配 ,HBE中有 2 2 2个未被匹配 ;对A 5 49和HBE中的 18个差异蛋白质点分别进行肽质指纹分析 ,经数据库查询 ,初步鉴定为一些与物质代谢、细胞因子、信号转导有关的蛋白质。提示人肺腺癌细胞A 5 49和正常细胞HBE的蛋白质组具有差异 ,这种蛋白质组的差异分析有助于进一步研究肺腺癌的相关蛋白质及分子标记物     

生物传感芯片质谱及其在蛋白质组研究中的应用

目前蛋白质组研究技术在已有的研究基础上取得了长足进展 ,包括固相 ｐＨ梯度双向凝胶电泳、生物质谱技术、蛋白质双向电泳图谱的数字化和各种分析技术、蛋白质间相互作用分析的方法如酵母双杂交系统、噬菌体展示、表面等离子共振等。但均各有其利弊。目前质谱是进行蛋白质组成分鉴定的支撑技术 ,但是它在蛋白质间相互作用分析及结构与功能的关系分析方面显得无能为力 ,而生物分子相互作用分析技术 (Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ ,ＢＩＡ)是进行蛋白质相互作用分析的较好技术 ,将两者结合起来在蛋白质组…     

人肺鳞癌组织的血清蛋白质组学的比较分析

采用以肿瘤免疫学与蛋白质组学(proteomics)研究技术有机地结合为基础的血清蛋白质组学研究体系(serologicproteomeanalysis ,SERPA)筛选肺癌分子标志物.对10例人肺鳞癌组织,应用双向凝胶电泳(two dimensionalelectrophoresis ,2 DE)技术对同一肺鳞癌组织的细胞总蛋白同时进行电泳后获得3张相同的凝胶,其中一块2 DE凝胶经银染显色作为平行胶,其余两块2 DE凝胶经电转膜将凝胶中的蛋白质转至硝酸纤维素(NC)膜上,然后分别与肺癌患者的自身血清以及正常对照血清进行Western印迹分析,获取Western印迹反应图谱.经计算机图像分析识别差异反应的蛋白质,然后与平行胶比较找出相应的差异反应蛋白质点.获得了分辨率较高的人肺鳞癌组织与患者的自身血清以及正常对照血清的Western印迹反应图谱;图像分析共识别36±8个差异反应的蛋白质;在平行胶上找到了匹配的差异反应蛋白质点.对2 0个差异蛋白质点进行了肽质指纹图分析,鉴定出14个与细胞生长增殖、细胞代谢、细胞周期调控、信号转导等有关的肺鳞癌相关抗原.通过血清蛋白质组技术对肺鳞癌组织进行的研究,建立了分辨率较高的人肺鳞癌组织与患者的自身血清以及正常血清的Western印迹反应图谱,成功鉴定14个肺鳞癌相关抗原,为进一步筛选用于肺鳞癌诊断、治疗和预后评估     

表皮生长因子受体调控的人鼻咽癌细胞系CNE2分泌蛋白质的筛选

为筛选表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)调控的鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)细胞的分泌蛋白质,揭示EGFR在NPC发病中的作用机制,采用无血清培养法培养NPC细胞系CNE2,并用转化生长因子(transforminggrowthfactor-α,TGF-α)刺激CNE2细胞24h作为实验组,对照组CNE2细胞不用TGF-α刺激.超滤法脱盐并浓缩两组细胞的培养上清制备分泌蛋白,采用双向凝胶电泳技术(two-dimensionalelectrophoresis,2-DE)分离两组细胞的分泌蛋白,PDquest图像分析软件识别差异表达的蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)鉴定差异表达蛋白.建立了实验组和对照组CNE2细胞分泌蛋白的2-DE图谱,图像分析识别了22个差异蛋白质点,质谱鉴定了8个非冗余蛋白质,其功能涉及肿瘤细胞侵袭转移、细胞凋亡和增殖,为进一步揭示EGFR在NPC发病中的作用及其机制奠定了基础.     

肿瘤: 一种蛋白质组病

恶性肿瘤的发生是一个涉及多因素、多基因的多阶段病理过程. 以往的研究主要集中在基因组和转录组分析. 随着人类基因组计划的完成, 肿瘤研究开始进入“后基因组时代”, 肿瘤蛋白质组学应运而生. 蛋白质作为基因功能的主要执行者, 一方面在肿瘤发生发展过程中扮演重要角色, 另一方面在很大程度上决定正常细胞和肿瘤细胞之间的差异(如异型性、恶性特征等). 本文提出, 肿瘤是一种蛋白质组病, 并根据肿瘤比较蛋白质组、表达蛋白质组、功能蛋白质组和结构蛋白质组研究进展, 从肿瘤发生发展过程中蛋白质(组)表达水平及状态、蛋白质翻译后修饰、蛋白质相互作用及网络调控等三个方面进行阐述. 该观点的提出, 将为肿瘤发病机制的研究开辟新的领域, 为肿瘤的诊断(如生物标志物筛选)和筛选(如药物新靶标)提供新的思路, 具有重要的科学意义和临床应用价值.     

NM23-H1、 DJ1 和 TIM1 在低分化鼻咽鳞癌 组织和 CNE2 细胞株中共同表达

鼻咽癌为一种好发于鼻咽顶前壁及咽隐窝的头颈肿瘤, 98% 属低分化鳞癌 . 鼻咽癌就诊的患者中约 75% 已有颈淋巴结转移,颅神经受累 ( Ⅱ ~ Ⅵ, Ⅸ ~ Ⅻ ) 也较易发生. CNE2 为一种低分化鼻咽鳞癌细胞系,其生物学行为具有低分化鼻咽鳞癌的一些共同特点 . 选择恶性程度高的鼻咽癌组织 ( Ⅳ期,低分化鼻咽鳞癌 ) 和恶性程度高的低分化鼻咽鳞癌细胞株 CNE2 为研究样本,应用双向凝胶电泳技术获得了 6 例分辨率较高、重复性较好的低分化鼻咽鳞癌组织和 CNE2 细胞系双向凝胶电泳图谱,利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF-MS) 技术,分析了 145 个蛋白质斑点 ( 组织 66 个点,细胞株 79 个点 ),共鉴定出了 74 种蛋白质,其中瘤基因 DJ1、转移相关基因 NM23-H1 和磷酸丙糖激酶异构酶 1(TIM1) 3 种蛋白质,在 CNE2 细胞系和该 6 例低分化鼻咽鳞癌组织中均共同表达 . 并进一步应用 RT-PCR 法检测低分化鼻咽鳞癌细胞系 CNE2 和 12 例低分化鼻咽鳞癌组织三者 mRNA 的表达：在细胞系 CNE2 和 3 例Ⅳ期低分化鼻咽鳞癌病人的组织中三者全表达, 3 例Ⅲ期及 6 例Ⅱ期也各有 1 例为全表达,而在正常对照的 6 例慢性鼻咽炎组织中未检测到三者的同时表达且有一例为全阴性, NM23-H1、 DJ1 和 TIM1 三者的 mRNA 在Ⅲ、Ⅳ期低分化鼻咽鳞癌组织共同表达,与正常对照组织相比,发现两者有显著性差异 (x²=10.214 , P＜0.005). NM23-H1、 DJ1 和 TIM1 三者的共同表达,可能与低分化鼻咽鳞癌的发生发展有关.     

人原发性肺腺癌转移相关分子的定量蛋白质组学研究

癌细胞转移是人原发性肺腺癌(lung adenocarcinoma, AdC)死亡率高和预后差的主要原因．为了筛选潜在的肺腺癌转移相关分子标志物,依据临床诊断选取无转移的肺腺癌组织和有转移的肺腺癌组织作为研究对象,首先采用激光捕获显微切割技术(laser capture microdissection, LCM)对两组肺腺癌组织中的癌细胞进行纯化,再利用荧光差异凝胶电泳技术(two-dimensional differential in-gel electrophoresis, 2D-DIGE)分离无转移肺腺癌组和有转移肺腺癌组的癌细胞总蛋白,通过Decyder软件分析两组差异表达的蛋白质点,质谱(mass spectrometry, MS)对差异表达的蛋白质点进行鉴定,Western blot验证部分差异蛋白annexin A1, annexin A2, annexin A3, B23和 S100A9的表达．建立了LCM 纯化的无转移和有转移的肺腺癌组织癌细胞的2D-DIGE图谱,质谱鉴定了20个非冗余差异蛋白质,其中12个蛋白质在有转移肺腺癌组中较无转移肺腺癌组表达上调,8个蛋白质在有转移肺腺癌组中表达下调．Western blot验证分析显示,差异蛋白annexin A1,annexin A2,annexin A3和 S100A9的表达水平在有转移肺腺癌中较无转移肺腺癌增高,B23的表达水平在有转移肺腺癌中较无转移肺腺癌降低．免疫组化进一步证实S100A9在有转移的肺腺癌中较无转移的肺腺癌中表达上调．首次应用LCM技术联合2D-DIGE及MS技术分析鉴定出肺腺癌转移相关蛋白质,为研究肺腺癌的转移分子机制、筛选预测肺腺癌转移的分子标志物奠定了基础．     

人支气管上皮不典型增生与浸润癌组织的比较蛋白质组学研究

为筛选支气管上皮鳞状不典型增生进展的分子标志物,采用改良的脱氧胆酸-三氯醋酸(deoxycholate-trichloroaetic acid, DOC-TCA)法提纯支气管上皮总蛋白质进行双向电泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）,应用ImageMaster 2D分析软件、Student’s t-检验识别差异蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）得到相应的肽质指纹图（peptide mass fingerprint,PMF）,搜索数据库鉴定差异蛋白质.由此获得人支气管上皮不典型增生和浸润癌组织的2-DE图谱及其凝胶的平均蛋白质点数（1 273.00±43.31,1 326.00±66.63）,且两阶段间平均差异蛋白质点数为 56.00±8.96.取38个差异蛋白质点进行PMF分析,鉴定出一些与细胞生长、分化或肿瘤发生等有关的蛋白质,随即应用免疫组化检测差异蛋白质EGFR、c-Jun、Mdm2在两类组织中的表达,其结果也显示了类似的表达差异.支气管上皮不典型增生恶性转化过程中存在蛋白质的差异表达,这些差异蛋白质可能以不同的方式参与了癌变过程,且EGFR、c-Jun、Mdm2的免疫组化验证结果与质谱结果的一致性表明,比较蛋白质组学是一种筛选癌变相关分子标志物的可靠方法之一.     

应用磷酸化蛋白质组学方法初步研究喉癌相关基因 LCRG1 的功能

mRNA 差异显示技术克隆的喉癌相关基因 LCRG1 ,对不表达该基因的喉癌细胞系 (Hep-2) 的生长具有明显抑制作用 . 软件分析推测, LCRG1 可能在细胞信号传导中发挥作用 . 为进一步地研究 LCRG1 的功能,应用 RT-PCR 和平板克隆形成实验证实,经多次传代的 Hep-2/LCRG1 细胞,仍表达 LCRG1 ,且 LCRG1 具有显著的抑制细胞增殖的能力 . 抽提 Hep-2/LCRG1 和 Hep-2/pcDNA3.1(+) 细胞系总蛋白质,应用固相 pH 梯度 (IPG) 双向凝胶电泳 (2DGE) ,结合抗酪氨酸磷酸化抗体的免疫印迹和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF-MS) ,鉴定酪氨酸磷酸化的蛋白质 . 得到了分辨率较高、重复性较好的 Hep-2/LCRG1 和 Hep-2/pcDNA3.1(+) 细胞系的总蛋白质双向凝胶电泳图谱;结合免疫印迹反应、软件分析和质谱技术识别并鉴定了 13 个差异反应的酪氨酸磷酸化的蛋白质 . 这些蛋白质参与了细胞信号传导和细胞代谢等过程 . 推测 LCRG1 可能是通过调节这些蛋白质的酪氨酸磷酸化、去磷酸化状态,参与细胞增殖、代谢和凋亡等过程的调控,而发挥抑瘤作用 . 这为全面、真实地揭示 LCRG1 抑瘤作用的分子机理提供了新思路 .     

PPFP基因促进人正常甲状腺细胞Nthy-ori 3-1增殖和迁徙运动能力的体外实验研究

目的:研究PPFP基因对人正常甲状腺细胞Nthy-ori 3-1生物学特性的影响,以明确PPFP是否具有致瘤作用。方法以我们前期实验构建的PPFP基因慢病毒载体稳定转染细胞株Nthy-ori 3-1PPFP、空白慢病毒载体稳定转染细胞株Nthy-ori 3-1Vector和未转染细胞株Nthy-ori 3-1为研究对象,以MTT法检测细胞增殖情况,平板克隆形成实验检测克隆形成数,软琼脂集落形成实验检测集落形成率,划痕愈合实验观察各组细胞体外迁徙运动能力,流式细胞仪检测各组细胞凋亡和细胞周期。结果以Nthy-ori 3-1Vector组和Nthy-ori 3-1组细胞为对照组,Nthy-ori 3-1PPFP组细胞较对照组在细胞增殖能力、平板克隆形成数、软琼脂集落形成率、体外迁徙运动能力均明显提高或增强,而细胞凋亡率明显下降,G0/G1期细胞明显减少,S期及G2/M期细胞则显著增加。结论PPFP基因可显著促进人正常甲状腺细胞Nthyori 3-1的增殖能力,并显著抑制其凋亡和促进其迁徙运动能力,提示该基因可能在滤泡状甲状腺癌恶性增殖和侵袭转移过程中起关键性作用。