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将经RACE方法克隆到的青蒿倍半萜合酶cDNA(AF304444) 开放阅读框插入到原核表达载体pET30a(+)的NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点之间,构建N端和C端均携带有HIS6表达标签的重组表达载体pET30SESQ。将pET30SESQ转入大肠杆菌BL21(DE3), IPTG(Isopropyl-beta-D-thiogalactoside)诱导蛋白表达,表达产物经镍琼脂糖柱纯化。纯化蛋白加入酶促反应体系(FPP),GC-MS分析酶促反应体系的正己烷萃取物,结果显示此重组酶可以催化FPP向法呢醇的转化。 相似文献
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用RACE方法从青蒿(Artemisia annua L.)高产株系001中克隆了一个过氧化物酶.将此基因在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS细胞中进行原核表达得到重组蛋白(APOD1),表达的蛋白分别以抗坏血酸、愈创木酚为底物进行过氧化反应,结果显示,APOD1催化愈创木酚的活力是抗坏血酸的1.8倍左右,由此表明,克隆的APOD1类属于植物经典过氧化物酶(第三大类过氧化物酶).经与其他植物过氧化物酶同源性比较分析,推测APOD1的氨基酸序列与白羽扇豆(Lupinus albus)、辣根菜(Armoracia rusticana)、小麦(Triticum aestivum)、烟草(Nicotiana tabacum)和蕃茄(Lycopersicon esculentum)的一致性分别为42.0%、36.2%、38.9%、33.6%和32.8%.Northern杂交分析表明,此基因在青蒿的根、茎和叶中均有表达.加入APOD1至青蒿细胞提取液有利于青蒿酸向青蒿素的生物转化,但APOD1并不能直接以青蒿酸作为氧化底物. 相似文献
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为了解决在一些特殊位点上利用Quick Change方法进行定点突变时会在突变位点处额外插入引物序列导致突变失败的问题,对Quick Change法进行了改良。改良方法为:合成在突变位点处点突变的一对反向互补引物,分别进行单引物PCR扩增,将两种扩增产物混合,变性复性后加入Dpn I进行酶切,酶切产物转化大肠杆菌DH5α,抗性筛选阳性克隆进行测序验证。利用此法成功突变紫穗槐二烯合酶(amorpha-4,11-diene synthase,ADS)基因中多个利用常规方法突变均因引入额外引物而无法成功的特殊位点,证明此方法实践上可行,而且也可以避免插入额外引物序列,这也从侧面证明额外引物插入的原因是双引物同时反应。 相似文献
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