过表达Dbtnbt基因提高中国红豆杉细胞的紫杉醇含量

本文通过克隆3′-N-去苯甲酰紫杉醇N-苯甲酰转移酶（3′-N-debenzoyltaxol-N-benzoyltransferase,DBTNBT）基因Dbtnbt,构建其表达载体p1303-SDbtnbtN,转化中国红豆杉细胞,经潮霉素抗性筛选获得转基因细胞系. 转基因细胞分析结果表明,T-DNA及其包含的基因与宿主细胞染色体成功整合;转基因细胞中报告基因GusA-mgfp5正常表达;转基因细胞的Dbtnbt mRNA表达量是未转化细胞的1.33 倍;转基因细胞的紫杉醇产量约为27.3 μg/g,是未转化细胞的1.37倍. 本研究结果表明,过表达Dbtnbt基因将中国红豆杉细胞的紫杉醇产量提高约37%.     

ggpps 5′-侧翼序列的克隆及其启动子功能验证

目的：研究栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶（geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPPs）基因启动子的活性;方法：从曼地亚红豆杉细胞中克隆ggpps基因5′-侧翼序列,并将该侧翼序列代替pBI121质粒上的CaMV35S启动子,以Gus基因作为报告基因构建植物表达载体,并进一步导入农杆菌LBA4404中获得阳性转化子,然后用叶盘转化法验证该侧翼序列的启动子活性;结果：本研究从曼地亚红豆杉细胞中成功克隆了ggpps基因的5′-侧翼序列,并且验证了该侧翼序列具有启动子活性;结论：ggpps基因的5′-侧翼序列的测序结果表明本实验成功克隆了该侧翼序列,启动子功能验证结果表明ggpps 5′-侧翼序列具有启动子活性,这些结果为进一步的通过缺失法进行ggpps基因启动子功能研究奠定了基础。     

ggpps 5'-侧翼序列的克隆及其启动子功能验证

目的:研究牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPPs)基因启动子的活性;方法:从曼地亚红豆杉细胞中克隆ggpps基因5'-侧翼序列,并将该侧翼序列代替pBI121质粒上的CaMV35S启动子,以Gus基因作为报告基因构建植物表达载体,并进一步导入农杆菌LBA4404中获得阳性转化子,然后用叶盘转化法验证该侧翼序列的启动子活性;结果:本研究从曼地亚红豆杉细胞中成功克隆了ggpps基因的5'-侧翼序列,并且验证了该侧翼序列具有启动子活性;结论:ggpps基因的5'-侧翼序列的测序结果表明本实验成功克隆了该侧翼序列,启动子功能验证结果表明ggpps 5'-侧翼序列具有启动子活性,这些结果为进一步的通过缺失法进行ggpps基因启动子功能研究奠定了基础.     

筛选dbat启动子顺式元件结合蛋白的酵母单杂交文库的构建

旨在构建酵母单杂交文库用于筛选与dbat基因启动子顺式元件结合的转录因子.首先,分离dbat启动子上的顺式作用元件,并进行3个拷贝的重复后,和报告质粒pHis 2.1连接构建诱饵载体pHis 2.1-dp3.然后,从茉莉酸甲酯诱导的红豆杉细胞中提取总RNA,以纯化出的mRNA为模板,依次完成ss cDNA和ds cDNA的合成,并将纯化的ds cDNA、线性化载体pGADT7-Rec2和诱饵载体pHis 2.1-dp3共转化酵母细胞Y187,各取100 μl分别涂布于SD/-leu和SD/-leu/-trp平板,用于计算重组效率和转化效率,剩余转化液涂布于SD/-leu/-trp/-his/20 mM 3-AT平板,用于筛选阳性克隆.结果表明,重组效率为1.49×106 CFU/μg,共转化效率为1.93×105 CFU/μg;对阳性克隆质粒进行酶切、测序分析,得到6个可编码结合蛋白的基因.以上工作为筛选调控紫杉醇合成关键酶基因dbat表达的转录因子奠定了基础.