GFAP启动子调控的双顺反子真核表达载体pGFAP-IRES2-EGFP-p27的构建及表达分析

目的构建并鉴定带GFAP启动子的Flag-p27和EGFP双顺反子真核表达载体,观察其表达。方法利用IRES和GFAP启动子,通过质粒抽提、琼脂糖凝胶电泳、酶切、连接、转化等多种基因工程技术,经多步亚克隆后完成能同时表达p27和EGFP基因的星形胶质细胞特异性真核表达载体pGFAP-IRES2-EGFP-p27。转染体外培养的星形胶质细胞,观察EGFP的表达,并通过免疫荧光细胞化学技术观察p27的表达。结果经酶切鉴定和测序鉴定,成功构建真核表达载体pGFAP-IRES2-EGFP-p27。转染星形胶质细胞后可见EGFP的表达,并且在EGFP阳性的细胞中P27表达水平明显增高。结论GFAP启动子能启动目的基因p27和EGFP在星形胶质细胞的表达,连于Flag-p27的下游EGFP可作为报告基因,指示p27的表达情况。带启动子GFAP的Flag-p27和EGFP双顺反子真核表达载体的构建为进一步研究星形胶质细胞增生与神经系统疾病的关系,并为寻找神经系统疾病的有效基因治疗途径奠定基础。     

脑缺血后大鼠神经元和星形胶质细胞P21cip1表达的研究

目的研究大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子P21cip1在神经元和星形胶质细胞的表达。方法建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAo)再灌注模型,应用流式细胞术检测各组MCAo再灌注后不同时期神经元和星形胶质细胞中的P21cip1的表达。结果缺血侧皮层区星形胶质细胞和神经元中的P21cip1的表达在再灌注3d、7d、14d后表达下调,与假手术组比较有显著性差异(P<0.05);神经元中的P21cip1的表达和星形胶质细胞中的P21cip1的表达无显著性差异(P>0.05)。结论局灶性脑缺血再灌注损伤后,缺血侧皮层区星形胶质细胞和神经元的p21cip1表达下调。     

Olomoucine对星形胶质细胞增殖及活化分泌的影响

目的观察细胞周期抑制剂olomoucine对培养星形胶质细胞机械损伤后增殖和活化分泌的影响。方法建立体外培养大鼠纯化的AS物理损伤模型（划痕损伤模型）,分为对照组、划痕组和olomoucine干预组。利用免疫荧光细胞化学方法观察损伤后GFAP表达;利用RT-PCR观察细胞因子IL-6和TNF-α的表达情况。结果划痕损伤刺激能使培养AS反应性增生活化。损伤早期出现IL-6、TNF-α表达水平增高,从损伤后12h开始出现损伤边缘区AS胞体肥大,数目增加;给予olomoucine干预后,细胞数目减少、体积明显减小,损伤后IL-6和TNF-α表达也显著下降。结论损伤刺激可促使AS活化,并发生反应性胶质增生;CDK选择性细胞周期抑制剂olomoucine可以通过调控细胞周期,有效抑制损伤后星形胶质细胞的反应性增生,并能对AS的活化起到抑制作用。     

大鼠发育过程中海马细胞周期相关蛋白的表达与分布

目的观察正常SD大鼠发育过程中海马细胞周期相关蛋白表达及分布特点,探讨其与脑老化的关系.方法采用免疫组织化学方法观察不同发育时期(1周,2月,4月,10月,15月)Cyclin D1、CDK4、P16、NeuN表达的规律.结果在各年龄组Cyclin D1、CDK4、P16、NeuN阳性细胞层的厚度随着增龄而逐渐变薄.各阳性细胞的排列逐渐由紧密变得松散,胞体逐渐增大,各阳性细胞逐渐伸出轴突进入分子层.P16随月龄的增长在海马各区染色增强,但P16阳性细胞数目减少.结论 Cyclin D1、CDK4、P16、NeuN在海马发育的各个时期均有表达,老龄大鼠海马内Cyclin D1、CDK4、P16表达的下调提示细胞增殖活性受限,这可能与脑老化有关.     

大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合基因表达条件的优化

目的:对已构建的含有大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合基因的重组菌株进行鉴定和表达条件优化。方法:采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含ST1-LTB融合基因的重组质粒,同时用SDS-PAGE检测不同条件下ST1-LTB融合基因的表达情况。结果:酶切鉴定证实重组质粒pXSL1含有ST1-LTB融合基因且阅读框架正确,以IPTG为诱导剂诱导ST1-LTB融合基因表达的优化条件是:培养基pH7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.8mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5h,此时ST1-LTB融合蛋白表达量达35.2%。结论:实现ST1-LTB融合基因的高效表达,为大肠杆菌肠毒素双价基因工程菌苗的生产工艺研究提供了可靠的实验数据。     

X射线对体外培养星形胶质细胞增生活化和分泌的影响

目的观察X射线照射对培养星形胶质细胞(astrocyte,AS)增殖和分泌的影响。方法建立体外培养大鼠纯化的AS物理损伤模型(划痕损伤模型),分为对照组、划痕组和放疗组。利用免疫荧光观察胶质细胞胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxy uridine,BrdU)的表达,利用RT-PCR观察细胞因子IL-6和TNF-a的表达。结果划痕损伤刺激能使培养AS反应性增生活化。损伤后6h出现IL-6、TNF-a表达水平增高,24h后损伤周围BrdU阳性细胞率明显增加。通过X射线照射能抑制AS的BrdU表达,但并不能抑制损伤后IL-6和TNF-a的表达。结论X射线照射可以通过调控细胞周期,有效抑制损伤后AS的反应性增生,但不能对活化AS的IL-6和TNF-a的表达起到抑制作用。     

细胞周期调控对大鼠全脑缺血后海马迟发性神经元死亡的影响

目的观察细胞周期调控对大鼠全脑缺血再灌流后海马区迟发性神经元死亡(delayed neuronal death,DND)以及星形胶质细胞的活化、增殖的影响.方法建立大鼠短暂性全脑缺血再灌流模型,利用尼氏染色、TUNEL、免疫组织化学方法观察再灌流后细胞周期素依赖的蛋白激酶(cyclin depedent kinase, CDK)抑制剂Olomoucine对海马DND以及星形胶质细胞活化增殖的影响.结果全脑缺血再灌流后3d、7d、30d海马神经元明显脱失,部分CA1、CA2区神经元凋亡;星形胶质细胞数目增多,GFAP表达上调,应用Olomoucine后TUNEL阳性神经元数目明显减少,幸存神经元数目增加;星形胶质细胞数目无明显增多,GFAP表达明显下调.结论 CDK抑制剂Olomoucine可有效抑制大鼠全脑缺血后海马神经元DND以及星形胶质细胞活化增殖.