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利用CRISPR/Cas9技术靶向构建CAPNS1基因敲除人成神经瘤细胞SK-N-SH细胞系。在NCBI数据库查找人CAPNS1基因,获得该基因CDS区,根据CRISPR/Cas9敲除靶位点设计原则即g RNA设计原则,设计3条sg RNAs,以p GK1.1为载体,构建人CAPNS1基因敲除载体,并运用共转染的方法转染到SK-N-SH细胞,构建CAPNS1基因敲除SK-N-SH细胞系。结果发现,菌落PCR筛选均能扩增出100 bp大小的片段,单克隆为阳性,DNA测序显示sg RNA序列正确插入质粒,序列比对结果正确;质粒转染SK-N-SH细胞后,制备单克隆,CruiserTMEnzyme酶切后疑似为阳性克隆,进一步的单克隆测序结果显示CAPNS1基因敲除SK-N-SH细胞系构建成功;此外,在CAPNS1-/-组,CAPNS1蛋白及calpain1和calpain2蛋白水平明显降低。以上结果表明CAPNS1基因敲除SK-N-SH细胞系构建成功。 相似文献
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