过表达pps基因和aroG~(fbr)基因对北京棒杆菌L-色氨酸合成的影响

【目的】通过增加北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)PD-67芳香族氨基酸合成的前体物质磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的供应,解除终产物对芳香族氨基酸合成途径中第一个酶同时也是关键酶3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合酶(DS)的反馈抑制并提高抗反馈抑制的DS的活力,使碳流更多地流向芳香族氨基酸合成途径,从而积累更多L-色氨酸。【方法】运用PCR技术扩增北京棒杆菌PD-67磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因pps,与表达载体连接构建重组质粒pXPS;运用重叠PCR技术定点突变大肠杆菌(Escherichia coli)受苯丙氨酸调控的DS基因aroG,使相应的编码氨基酸序列发生突变:Leu175Asp,新的基因命名为aroGfbr,与表达载体连接构建重组质粒pXA;构建pps和aroGfbr的共表达重组质粒pXAPS。将3个重组质粒分别转入菌株PD-67,构建工程菌株PD-67/pXPS、PD-67/pXA和PD-67/pXAPS。通过摇瓶发酵研究工程菌株的发酵特性。【结果】酶活分析结果表明,pps基因和aroGfbr基因在北京棒杆菌PD-67中均实现了表达。工程菌株PD-67/pXA粗酶液DS抗反馈抑制分析表明,AroGfbr已解除酪氨酸和苯丙氨酸的反馈抑制。过表达pps基因和aroGfbr基因分别使工程菌L-色氨酸产量提高12.1%和26.8%,双基因共表达可使工程菌的产酸量提高35.9%。【结论】北京棒杆菌PD-67pps基因的过表达以及大肠杆菌来源的解除反馈抑制的aroGfbr的过表达均有助于增加PD-67 L-色氨酸的合成,而双基因的共表达可以进一步提高L-色氨酸的积累量。     

谷氨酸棒杆菌/大肠杆菌穿梭型启动子探测载体构建

从质粒pXZ10145和pUC19出发,构建了一个谷氨酸棒杆菌/大肠杆菌穿梭载体pAK6。pAK6的大小为5684bp,带有卡那霉素和氨苄青霉素抗性选择标记,以及多克隆位点。在pAK6基础上,构建了以氯霉素乙酰转移酶为报告基因的启动子探测载体pAKC6,pAKC6的大小为6474bp。采用鸟枪法,将经Sau3AI消化的谷氨酸棒杆菌基因组片段连入pAKC6;根据谷氨酸棒杆菌对氯霉素的抗性,从中分离出两个具有启动子功能的插入片段。通过测定报告基因氯霉素乙酰转移酶的活性,对两个启动子片段在谷氨酸棒杆菌中的强度进行了初步的判断;测序后,用启动子预测软件对其结构进行了预测,证实了启动子序列的存在。     

γ-谷氨酰激酶基因敲除对产L-精氨酸钝齿棒杆菌8-193 生理代谢的影响

摘要:【目的】为了阻断L-精氨酸合成的前体物L-谷氨酸的分支代谢途径,增加L-精氨酸合成的代谢流,构建钝齿棒杆菌8-193(Corynebacterium crenatum 8-193)γ-谷氨酰激酶( EC:2.7.2.11,γ-glutamyl kinase) 基因proB 敲除的菌株,并研究proB 基因敲除对菌株生理特性的影响。【方法】运用PCR 技术分别扩增proB 基因的上游和下游序列,构建带有内部缺失的proB 基因的敲除载体。经过两次同源重组,敲除C．crenatum 8-193 的pro     

退化泥炭地亚表层土壤酶活性与DOC变化规律研究

在气候变化背景下,泥炭地亚表层土壤有机碳逐渐参与到碳循环中,为揭示泥炭地亚表层碳输出与土壤酶活性的关系。以四川省红原县日干乔湿地自然保护区的泥炭沼泽(S1)、沼泽草甸(S2)、高寒草甸(S3)3种不同退化泥炭生态系统中不同深度(0—30 cm、30—60 cm、60—90 cm、90—120 cm、120—150 cm)的土壤作为研究对象,研究泥炭地表层(<30 cm)、亚表层(30—60 cm)和深层(>60 cm)土壤酶(酚氧化酶、β-葡萄糖苷酶、蔗糖酶)活性和土壤溶解性有机碳(DOC)的变化规律及二者的关系。结果显示,从泥炭沼泽到沼泽草甸再到高寒草甸的退化过程中, DOC含量逐渐增加。随着泥炭地退化程度的加深,土壤酶活性呈先升高后降低的变化趋势。从垂直方向来看,泥炭沼泽和沼泽草甸DOC从表层到亚表层逐渐增加,高寒草甸DOC从表层到亚表层逐渐减少;土壤酶中表层的酚氧化酶活性高于深层土壤,而深层土壤中的β-葡萄糖苷酶、蔗糖酶活性高于表层与亚表层。酚氧化酶活性、β-葡萄糖苷酶活性、蔗糖酶活性直接影响DOC含量变化。其中,β-葡萄糖甘酶在不同水位变动条件下都和DOC保持很好的...     

抗反馈抑制的天冬氨酸激酶基因在钝齿棒杆菌中的表达

将来自钝齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum）CD945具有AEC抗性的天冬氨酸激酶(AKfbr)基因克隆到穿梭载体pJC1上,构建重组质粒pLY153。用电击法将质粒pLY153转化到野生型菌株C. crenatum AS1.542及其突变株C. crenatum CD945中。携带AKfbr基因的C. crenatum AS1.542菌株能抗浓度皆为12mg/mL的AEC和苏氨酸。AKfbr基因在C. crenatum CD945中得到表达,天冬氨酸激酶活性提高4倍。摇瓶发酵实验结果表明,重组菌在对数前期和中期生长正常,不受抑制;与对照菌相比,赖氨酸终产量提高22％,赖氨酸生产率提高23％。     

微生理系统发展态势及对策建议

微生理系统属于生命科学与生物技术前沿交叉研究方向,为生命科学、医学研究以及新药研发等带来了新理念、新方法、新工具,显示出巨大发展前景。近年来,生物技术的快速发展以及和不同学科之间的交叉融合渗透,不仅促进了微生理系统领域的更快发展,也拓展了传统的生物医学研究和新药研发体系,推动生物医药创新发展进入新阶段。文章综合分析了国际微生理系统发展新阶段的特征和发展趋势,以及我国该领域的发展现状,在此基础上,提出我国微生理系统发展的对策建议。     

缺血预处理通过β2-肾上腺素受体保护心肌细胞收缩功能

本文旨在探讨缺血预处理(ischemic preconditioning, IP)对缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤心脏的保护机制,从细胞和受体水平研究β2-肾上腺素受体(β2-adrenoreceptor, β2-AR)是否参与了IP对I/R损伤心脏的保护作用.Sprague-Dawley大鼠随机分为单纯I/R组(对照组)、IP组、短暂异丙肾上腺素(isoproterenol, ISO)处理组、IP ICI118551组、ISO ICI118551组和ICI118551组.除对照组外,其它各组大鼠处理后均行缺血30min/复灌30min.记录心脏收缩期左心室内压上升的最大变化速率( dp/dtmax)、舒张期左心室内压下降的最大变化速率(-dp/dtmax)及左心室内压差(difference of left ventricular pressure, ΔLVP,左心室收缩压-左心室舒张压).测定冠状动脉流出液乳酸脱氢酶(1actate dehydrogenase, LDH)含量.进一步酶解分离心脏,获得单个心室肌细胞,测定其存活率和收缩功能.结果显示,IP和ISO组±dp/dtmax、ΔLVP较对照组增高;心肌细胞存活率和收缩幅度也显著升高;收缩时间(time-to-peak contraction, TTP)缩短;冠状动脉流出液LDH含量减少.选择性β2-AR拮抗剂ICl118551阻断IP和ISO的作用.各组间心肌细胞舒张50%时间(time-to-50% relaxation, R50)和舒张100%时间(time-to-100% relaxation, R100)均无明显差异.结果提示,β2-AR可能在IP对I/R损伤心脏的保护作用中发挥重要作用.     

北京棒杆菌芳香族氨基酸转运蛋白基因敲除对L-色氨酸积累的影响

[目的]为了减少北京棒杆菌PD-67(Corynebacterium pekinense PD-67)从细胞外吸收色氨酸,降低细胞内色氨酸库的浓度,从而使色氨酸的反馈控制作用减弱,增加胞外L-色氨酸的积累量,构建北京棒杆菌PD-67的芳香族氨基酸转运蛋白基因aroP敲除的菌株,研究aroP基因敲除对菌株L-色氨酸积累的影响.并进一步研究在aroP敲除菌株中表达邻氨基苯甲酸合成酶(AS)基因对L-色氨酸积累的影响.[方法]运用PCR技术扩增aroP基因,与整合质粒连接后,用限制性内切酶法构建带有内部片段缺失的aroP基因的敲除载体.利用同源重组技术,敲除北京棒杆菌PD-67的aroP基因,构建菌株PD-67 ΔaroP,并用带有aroP基因的表达载体对PD-67ΔaroP进行互补验证.采用PCR技术扩增AS基因,与表达载体连接构建重组质粒.将重组质粒转入菌株PD-67ΔaroP,构建工程菌株PD-67 ΔaroP/pXAS.通过摇瓶发酵研究PD-67 AaroP和PD-67 ΔaroP/pXAS的发酵特性.[结果]经PCR验证获得了aroP基因缺陷的菌株.摇瓶发酵结果表明,与出发菌株相比,PD-67ΔaroP的L-色氨酸的积累量提高了65％.酶活分析结果表明,AS基因在菌株PD-67 △aroP中得到表达.AS基因表达使工程菌单位菌体产酸率提高了25.6％.[结论]北京棒杆菌PD-67中芳香族氨基酸转运蛋白基因arop的敲除能够提高胞外L-色氨酸的积累量.在arop基因敲除菌中表达AS基因,可以进一步提高工程菌的产酸率.     

苝醌类化合物的杀线虫活性*

采用液体浸泡方法首次测定了菌寄生菌属Hypomyces sp.的次级代谢物苝醌类化合物竹红菌甲素和痂囊羟菌素对松材线虫的致病率。结果表明竹红菌甲素对松材线虫的半致病率为18小时50g/mL,痂囊羟菌素对松材线虫的半致病率为18小时15g/mL,对比(啊维菌素)对松材线虫的半致病率为18小时0.8g/mL。在红外光照射下竹红菌甲素和痂囊羟菌素具有良好的光敏杀伤松材线虫的作用。     

青藏高原泥炭地水位下降促进土壤碳积累的影响机制

酚类物质作为泥炭地重要的碳分解抑制剂,植被作为泥炭地关键的碳输入来源,它们在土壤碳(可溶性有机碳(DOC)等)周转过程中都发挥着重要作用。然而,目前关于植被群落结构、酚类物质以及DOC含量对水位波动的响应存在较大争议。因此,为明确泥炭地水位下降对植被群落结构、酚类物质以及DOC含量的影响并探明三者间的潜在联系,以若尔盖高原泥炭地作为研究对象,选取红原县日干乔地区3处不同地下水位泥炭地(水位由高到低依次为S1(-1.9 cm)、S2(-10 cm)、S3(-19 cm)样地),调查不同水位条件下植被群落结构特征,并探究酚类物质及土壤碳含量对水位波动的响应。结果表明:(1)从S1到S3样地水位下降促进土壤DOC显著增加(P<0.05),土壤总碳从S1到S2显著增加(P<0.05),而从S2到S3无显著差异;(2)泥炭地水位下降促使禾本科(发草Deschampsia cespitosa)、莎草科(木里薹草Carex muliensis、乌拉草Carex meyeriana)植物大量出现,植被群落高度显著增加(P<0.05)。植被群落地上生物量由153.67 g/m~2增加至...