人激肽释放酶-1在甲醇酵母中高水平表达、纯化与鉴定

将自肾脏cDNA中获得的人激肽释放酶-1(Human kallikrein 1, hK1)基因插入到pPICZαA载体中, 构建甲醇酵母分泌型表达载体pPICZα-hK1, 该载体转化毕赤酵母(Pichia pastoris)宿主菌X33, 通过提高YPD平板和培养液中抗生素Zeocin的浓度(500~700 μg/mL), 筛选能高水平表达重组人激肽释放酶-1(Recombinant human kallikrein 1, rhK1)的P. pastoris工程菌株。在30 L发酵罐中发酵的表达条件为30oC、pH 6.0, 诱导64 h时, 发酵上清中rhK1产量达到6500 u/L(约1.25 g/L)。表达的rhK1有N-型糖基化程度不同的两种类型, 分别是分子量偏大的rhK1-H和分子量略小的rhK1-L。通过苯基疏水作用、Cu2+螯合以及阴离子交换层析纯化, 从每升发酵上清中可获得0.28 g的rhK1-H和0.62 g的rhK1-L, 纯化的总得率约为72%, 纯度不低于96%。到目前为止, 该研究获得的rhK1产量高于其他研究者的结果。