转录因子NF-YA真核表达载体的构建及转染HeLa细胞中的表达

目的:构建pAAV-NF-YA真核表达栽体并转染子宫颈癌HeLa细胞,检测NF-YA的表达水平.方法:抽提人类胚胎干细胞和胚胎成纤维细胞的总RNA,RT-PCR获得NF-YA基因的cDNA,克隆至pAAV-MCS载体中,经限制性酶切和测序鉴定后,重组质粒pAAV-NF-YA转粢HeLa细胞,Western Blot检测NF-YA的表达.结果:成功构建了NF-YA的真核表达载体,转染HeLa细胞后NF-YA的表达水平有显著提高.结论:获得了有效的pAAV-NF-YA真核表达载体,为后续NF-Y的功能研究提供了便利.     

人类胚胎干细胞分化前后CDCA8基因启动子区甲基化状态的实验研究

目的：分析在人类胚胎干细胞分化过程中,CDCA8基因启动子区甲基化的状态.方法：生物信息学预测人类CDCA8基因上游2 kb区域的CpG岛.抽提未分化和自然分化的人类胚胎干细胞gDNA,应用重亚硫酸盐修饰和DNA序列分析方法检测CDCA8基因启动子区CpG岛甲基化情况.结果：未分化和自然分化的人类胚胎干细胞中,被检测的CDCA8基因启动子区CpC岛均未发现明显的甲基化修饰.结论：在人类胚胎干细胞分化前后,CDCA8基因启动子关键区域的甲基化状态未发生明显改变.     

NTERA-2细胞中人类CDCA8基因的转录因子谱的芯片分析

为了研究细胞周期相关基因8（CDCA8）的转录调控机制,首先克隆了人类CDCA8基因5’端上游的1071 bp转录调控区。生物信息学预测发现,此区域存在一系列已知转录因子的可能结合位点。联合运用DNA pull-down和转录因子芯片技术分析发现共有114种转录因子在人恶性多发性畸胎瘤细胞（NTERA-2）中与该区域结合, 其中某些转录因子有预测的结合位点,其他没有预测结合位点的转录因子可能是以复合物的形式结合到CDCA8基因的转录调控区。     

基于重叠延伸PCR法的定点突变技术

目的:建立一种高效而经济的定点突变方法。方法:采用重叠延伸PCR定点突变技术,引物设计时引入目的突变,以前两次PCR产物为模板,进行第三次PCR,即可获得突变后的目的DNA片段。将此片段连入pMDTM18-T载体后测序验证突变结果。结果:DNA测序表明,待突变位点已由ATTGG突变为ATTTT。结论:成功实现了目的位点的定点突变,重叠延伸PCR法是一种高效且经济的定点突变方法。