肿瘤坏死因子α突变型斑马鱼在海分枝杆菌感染中的应用研究

肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)作为重要的炎性细胞因子,在类风湿关节炎、感染性休克等疾病的发病中起重要作用。为探究TNF-α在宿主抵抗海分枝杆菌感染中的作用,本研究采用成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9[clustered regularly interspaced short palindromic repeat(CRISPR)/CRISPR-associated protein 9(Cas9),CRISPR/Cas9]技术,使野生型斑马鱼TNF-α基因发生突变,成功构建并筛选出含有移码突变的TNF-α突变型(TNF-α-/-)斑马鱼。利用原位杂交技术,发现TNF-α-/-斑马鱼中TNF-αmRNA表达水平显著降低。与野生型斑马鱼相比,海分枝杆菌在TNF-α-/-斑马鱼体内扩散和增殖更显著。结果提示,本研究成功构建TNF-α-/-斑马鱼,有助于深入探究TNF-α在斑马鱼抵抗海分枝杆菌感染中的作用及其免疫调节机制。     

荔枝蒂蛀虫信息素结合蛋白基因序列及表达分析

【目的】获得荔枝蒂蛀虫Conopomorpha sinensis 3个信息素结合蛋白(PBP)基因的全长序列,并分析序列和表达特征,为更好地利用性信息素防治该虫提供必要的基础。【方法】提取荔枝蒂蛀虫触角总RNA,利用转录组测序结果和RACE-PCR技术获得3个PBP基因的全长序列;对序列进行生物信息学分析,用I-TASSER在线软件建立蛋白三维模型,用TM-align软件进行同源建模,用COACH软件推测蛋白的结合位点;用荧光定量PCR方法分析这3个基因在不同龄期(幼虫和蛹)和3日龄雌雄成虫不同组织[触角、头(去除触角)、胸、腹、足和翅]中的表达谱。【结果】从荔枝蒂蛀虫触角中克隆了3个PBP基因的全长序列,分别命名为Csin PBP1,Csin PBP2和Csin PBP3(Gen Bank登录号:MF093145,MF093146和MF093147)。序列分析结果表明,这3个基因的编码蛋白具有昆虫气味结合蛋白的典型特征,并且Csin PBP1与紫色卷蛾Yponomeuta cagnagellus PBP的氨基酸序列一致性达72%,Csin PBP2与小菜蛾Plutella xylostella PBP1的氨基酸序列一致性达55%,Csin PBP3与水稻大螟Sesamia inferens PBP3的氨基酸序列一致性达39%。软件模拟分析表明,Csin PBP1,Csin PBP2和Csin PBP3蛋白的三维结构分别与家蚕Bombyx mori普通气味结合蛋白2(GOBP2)(PDB:2wc6A)、脐橙螟Amyetois transitetella PBP1(PDB:4inx A)和家蚕PBP(PDB:2p70A)相似度最高,分别预测得到10,7和8个结合位点。表达谱分析显示,3个基因均只在成虫触角中表达,在幼虫期和蛹期不表达,在成虫头(去除触角)、胸、腹、足和翅中也不表达,且在雄虫触角中的表达量分别是雌虫中表达量的1.94,28.19和32.94倍。【结论】获得荔枝蒂蛀虫3个PBP基因的全长序列,序列和表达分析结果提示这3个基因与雄虫感受性信息素有关。     

饥饿对幼年斑马鱼下丘脑摄食相关性神经肽表达的影响

脊椎动物下丘脑中的神经肽Y(Neuropeptide Y, NPY)、GALANIN和GMAP蛋白前体(GALANIN and GMAP prepropeptide, GAL)、Agouti相关蛋白(Agouti related neuropeptide, AGRP)和阿片促黑色素原(Proopiomelanocortin, POMC)与摄食密切相关,但在斑马鱼中对这些神经肽与摄食之间关系的研究较少。本文通过原位杂交技术和实时定量PCR方法,观察饥饿1 d、饥饿2 d和饥饿2 d喂食2 d后斑马鱼下丘脑中npy、galanin、agrp和pomca的表达情况。结果显示,饥饿处理之后,agrp和galanin在斑马鱼下丘脑中的表达量显著上升(P<0.05)。与对照组相比,饥饿2 d后斑马鱼下丘脑中pomca表达量显著下降(P<0.05)。饥饿2 d喂食2 d后斑马鱼下丘脑中pomca、agrp和galanin的表达量与对照组相比没有显著性差异。所有实验中npy在斑马鱼下丘脑中的表达没有显著性差异。这表明饥饿处理促使斑马鱼下丘脑中agrp和galanin表达上调,pomca表达下调;及时摄食可以恢复agrp、galanin和pomca在下丘脑中的表达水平。