低浓度血清促进胚胎肝祖细胞诱导分化

为了探讨不同血清浓度诱导培养条件下对体外诱导胚胎肝祖细胞成熟分化的影响。本研究选用含有10%FBS、5%FBS、2%FBS的DMEM/HGF/FGF4肝细胞培养基体外诱导胚胎肝祖细胞的成熟分化,分别于诱导后0d、3d、6d、9d、12dALB-GLuc检测细胞白蛋白的合成水平,细胞计数检测细胞的成长曲线。RT-PCR检测肝细胞相关标志DLK、AFP、CK18,免疫荧光检测ALB、UGT1A的表达情况。ICG摄取和尿素氮检测肝细胞成熟功能。诱导后第三天,ALB-GLuc开始增高,于第9天达高峰,2%FBS组ALB-GLuc读数最高。生长曲线显示低血清浓度下细胞的增殖速度明显慢于高血清浓度。RT-PCR和免疫荧光结果显示诱导后第9天,3个诱导组DLK、AFP表达低于无诱导组,CK18、ALB、UGT1A均高于无诱导组,2%FBS组差异最显著。3个诱导组的肝细胞ICG摄取能力明显增高,2%FBS组ICG阳性细胞数为(60.2±9.0)%,明显高于5%FBS(45.0±3.6)%及10%FBS组(35.2±2.9)%,诱导后肝细胞的尿素合成功能增强,尤其是2%FBS组。低浓度血清培养条件能更好的诱导胚胎肝祖细胞的体外成熟分化。     

稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株的构建

目的构建稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株。方法PCR扩增获得ALB启动子,并与pBGLuc连接获得携带ALB启动子及荧光素酶报告基因的pBGLuc—ALB质粒,脂质体转染质粒到不同细胞,ALB—GLuc活性检测功能。构建逆转录病毒,感染HP14．5肝干细胞株获得携带ALB启动子及荧光素酶报告基因的稳定细胞株,经Dex、HGF体外诱导后第3、6、9、12天ALB—GLuc检测荧光素酶活性,免疫荧光检测ALB的表达。结果PCR、酶切及测序结果显示ALB启动子正确插入至荧光素酶GLuc基因上游,HEK293、HP14．5、LC14d及Hepa1-6细胞中ALB—GLuc活性与免疫荧光结果一致。HP14．5ALB—Gluc稳定细胞株在高浓度的稻瘟菌素中存活,免疫荧光结果显示Dex、HGF诱导后细胞中ALB的表达逐渐增强,并与ALB—Gluc活性升高一致。结论成功构建了稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株,为研究肝干细胞的体外成熟分化提供了重要的细胞手段。