用P. pastoris的pAOX1表达系统表达木糖异构酶

目的:应用P. pastoris的pAOX1表达系统分泌表达重组木糖异构酶.方法:用PCR法从大肠杆菌基因组中扩增木糖异构酶基因(xi).用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切将其基因克隆进P. pastoris表达载体.通过电转法将其木糖异构酶基因重组于P. pastoris基因组,筛选G418抗性700μg/ml的重组子作为工程菌GS115(pPIC9K-xi).在摇瓶中发酵用甲醇诱导表达重组木糖异构酶.用SDS-PAGE分析重组蛋白的表达情况,用糖酵解法对表达产物进行活性分析.结果:木糖异构酶基因在pAOX1的调控下,在P. pastoris中经甲醇诱导能分泌表达,摇瓶发酵2d表达量为35mg/L,表达产物具有代谢木糖的作用.结论:成功地克隆了大肠杆菌的木糖异构酶基因,并实现用pAOX1系统在P. pastoris中表达中木糖异构酶,为用P. pastoris规模化生产重组木糖异构酶奠定了基础.     

陆地棉纤维长度和强度的优异位点挖掘及其候选基因预测

纤维长度和强度是陆地棉(Gossypium hirsutum L.)纤维品质性状中的2个关键性状,其遗传基础的解析对优质棉品种培育具有重要意义.本研究以315个陆地棉品种(系)为关联分析群体,利用混合线性模型(MLM,mixed linear model)对来自5个环境的纤维长度和强度进行全基因组关联分析(GWAS,g...     

Pichia Pastoris表达系统的启动子研究进展

Pichia Pastoris是近年迅速发展的一种真核表达宿主,具有高效和适于进行高密度发酵等优点,已广泛应用于生产重组蛋白.启动子是表达系统重要组成部分中表达载体的核心元件,它的特性直接影响着它所调控的外源基因的表达.本文简要介绍了P.pastoris表达系统启动子pAOX1,pFLD1,pGAP,pYPT1和pICL1研究进展.     

工程菌P.pastoris GS115(pPIC9K-lac2)的构建及诱导表达漆酶的研究

用PCR法扩增枯草芽孢杆菌的漆酶基因lac2.构建表达质粒pPIC9K-lac2.通过电转法将lac2基因重组于P.pastoris基因组,筛选高G418抗性和高表达漆酶的转化子作为工程菌GS115(pPIC9K-lac2).在发酵罐中发酵GS115(pPIC9K-lac2)表达重组蛋白.在50 L发酵罐中加入20 L无机盐发酵培养基.在发酵的第一阶段连续24 h补加50％甘油-0.8％ PTM4增殖P.pastoris,然后用甲醇-0.8％ PTM4诱导49 h.在发酵过程中,通过调节搅拌的频率和通气量,将溶氧维持于20％ ～30％,用氨水维持pH 5.0.放罐时生物量为A600=266.5,表达漆酶1097.5U/L发酵液.     

用毕赤酵母的GAP启动子调控表达L-阿拉伯糖异构酶

应用PCR从大肠杆菌基因组中扩增L-阿拉伯糖异构酶基因,用EcoR I和Not I双酶切将其克隆进P.pastoris表达载体,获得重组表达载体pGAP9K-L-ai。通过电转法将pGAP9K—L-ai转化毕赤酵母GS115,筛选高G418抗性和高表达L-阿拉伯糖异构酶的重组工程菌。用葡萄糖作为碳源在摇瓶中发酵48 h,表达重组L-ai 53 mg/L。用毕赤酵母的GAP启动子调控表达的重组L-ai具有异构D-半乳糖生成D-塔格糖的生物学活性。     

以甘油为碳源发酵Pichia pastoris组成型表达人血管生成抑制素

在Pichia pastoris组成型表达外源蛋白中碳源起着重要的调控作用。分别以葡萄糖、甘油、甲醇和油酸为碳源研究它们对摇瓶发酵GS115(pGAP9K-AS)表达hAS的影响。结果如下:油酸(163mg/L),甘油(83mg/L),葡萄糖(76mg/L),甲醇(57mg/L)。根据以上结果,以甘油为碳源在30L生物反应器中进行GS115(pGAP9K-AS)工程菌的高密度发酵。48h后测得hAS的产量为169mg/L。产物hAS具有免疫活性并能抑制bFGF诱导的CAM血管生成和实验小鼠黑色素瘤的生长。治疗12d后,抑瘤率达到90%,统计学分析结果表明hAS治疗组和PBS治疗组小鼠的肿瘤体积呈现显著性差异(P<0.01)。     

用P.pastoris表达L-阿拉伯糖异构酶及其酶活性分析

目的:用毕赤酵母表达L-阿拉伯糖异构酶。方法:用PCR法扩增大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因,构建含L-阿拉伯糖异构酶基因的毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K-ai。通过电转法将pPIC9K-ai转化毕赤酵母GS115基因组。先筛选出高G418抗性的克隆,然后再从高拷贝的克隆中筛选出高表达重组L-阿拉伯糖异构酶的重组子作为工程菌GS115(pPIC9K-ai)。结果:在甲醇诱导下,摇瓶发酵GS115(pPIC9K-ai)3d,分泌表达L-阿拉伯糖异构酶32 mg/L。结论:毕赤酵母表达的L-阿拉伯糖异构酶具有转化D-半乳糖为D-塔格糖的生物活性。每升GS115(pPIC9K-ai)发酵液能转化D-半乳糖生成30 mgD-塔格糖。     

钙网蛋白-N58在毕赤酵母中的表达及活性分析

目的：利用毕赤酵母表达系统表达Calreticulin-N58蛋白。方法：利用重叠延伸PCR方法合成Calreticulin-N58基因,构建成分泌型的重组表达载体pPIC9K-CRT-N58。该重组表达载体经SacI线性化后,电激转化入毕赤酵母GSll5,经MD板和不同浓度G418筛选得到多拷贝重组菌株。经甲醇诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达情况,在鸡胚中进行活性分析。结果：重组质粒pPIC9K-CRT-N58在毕赤酵母中经甲醇诱导能分泌表达CRT-N58蛋白,摇瓶表达量大约为60mg／L,纯化的目的蛋白有显著的血管生成抑制作用。结论：实验成功地在毕赤酵母表达系统中实现了Calreticulin-N58的分泌表达。为Calreticulin-N58蛋白的进一步药用研究奠定了基础。     

用E．coli表达Canstatin—N及其表达条件优化

以重组质粒DET—CN为模板设计引物CASN1N和CASN2,PCR方法扩增约267bp的人血管能抑素N端1～89氨基酸基因片段,用EcoRI和Sal I双酶切将其克隆进pET-22b（＋）载体获得重组表达质粒pET-22b（＋）一CN,转化E．coliBL21（DE3）,用IPTG诱导表达Canstatin-N,产物以包涵体形式存在。本文在摇瓶发酵条件下研究了诱导剂浓度、诱导培养时间对目标蛋白表达的影响,结果表明IPTG的最佳诱导浓度为0．1mmol／L;37℃下诱导培养2h时产物表达量最高。纯化获得的融合hiS6的重组Canstatin—N具有免疫和抑制鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）新生血管生成活性。     

神经毒素BMAA在淡水池塘水体中的健康风险及调控技术

为掌握中国常见淡水养殖生态系统中神经毒素β-N-甲氨基-L-丙氨酸BMAA的污染水平,文章选取典型淡水养殖池塘的水体、底泥及6种水产品(河蚬、铜锈环棱螺、日本沼虾、中华绒螯蟹、青鱼和鲫)进行BMAA的含量检测,在此基础上开展BMAA对人体的健康风险评估.同时采用L-半胱氨酸修饰后的氧化石墨烯为载体,结合化感物质"没食子...