不稳定EGFP细胞模型的构建及其在基因编辑体系评价中的应用*

目的:为了更好地评价基因编辑效率,满足高通量筛选应用中快速、高效的检测要求,在细胞上建立一个原位检测方法具有重要的意义。通过检测荧光蛋白信号强度的变化可以评价CRISPR系统在细胞中的基因编辑情况,然而这一方法的效率受限于荧光蛋白较长的半衰期。方法:将鸟氨酸脱羧酶降解结构域(含PEST序列)与EGFP融合,通过慢病毒系统感染HEK-293T细胞,获得了表达单拷贝、EGFP-PEST报告基因的稳转细胞系。结果:与EGFP相比,EGFP-PEST在细胞内的降解速度明显加快,荧光水平在4 h内显著降低。利用该模型比较了3种商品化脂质体介导的CRISPR/Cas9基因编辑效率,能够在2~4 d实现定性和定量评价。结论:这一模型能够快速、灵敏地指示基因编辑效果,可以用于不同CRISPR系统或新递送工具的高通量筛选和评价。     

功能性新型冠状病毒RBD结构域在毕赤酵母表面的展示*

目的:设计并构建新型冠状病毒(SARS-CoV-2)受体结合结构域(receptor binding domain,RBD)在毕赤酵母表面的展示体系,并对表面展示的RBD进行功能性评价,从而为以RBD为靶点的高通量药物筛选平台奠定基础。方法:将四种锚定分子与新冠病毒RBD融合,电转化至毕赤酵母中;通过细胞免疫荧光分析,筛选能够成功展示RBD的锚定系统;进一步分析其与血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)受体的亲和力,证明展示在细胞表面RBD分子的功能。结果:仅Sed1p锚定分子能够有效呈递RBD至毕赤酵母细胞表面,展示效率约为70%;亲和力分析结果表明,ACE2受体和表面展示RBD的亲和力(K_D = 30.42 nmol/L)与溶液中RBD的亲和力(K_D = 16.00 nmol/L)较为接近。结论:这一体系能够在毕赤酵母表面高效地展示具有生物学功能的RBD,可用于抗新冠病毒RBD药物的高通量筛选和评价。     

前列腺干细胞抗原(PSCA)的表达及其特异结合肽的筛选

通过反转录 PCR从人前列腺癌细胞中克隆了前列腺干细胞抗原 (PSCA)基因 ,在大肠杆菌中利用pQE30载体对截断型PSCA基因进行了可溶性表达。蛋白纯化后 ,利用噬菌体随机展示 12肽库筛选了PSCA蛋白的特异结合肽 ,通过与EGFP蛋白的耦联表达验证了结合肽的特异性。此特异结合肽的获得 ,为进一步研究针对PSCA的前列腺癌靶向免疫治疗奠定了基础     

报告基因法在生物技术药物活性检测中的应用

随着生物技术药物研发数量的增多,对建立相应生物活性分析方法的需求不断上升。报告基因法作为一种研究基因转录活性和表达水平的工具,由于其快速、灵敏、稳定的特性,越来越多地应用于药物活性检测,包括细胞因子、抗体、激素等各类生物制品。我们就报告基因法在生物技术药物活性测定及药物研发进程中的应用做简要综述。     

脊柱跳跃型骨折的临床研究进展

脊柱跳跃型骨折指多节段非相邻的椎体骨折(multiple-level noncontiguous spinal fractures,MNSF)。对于非高龄患者,此类骨折通常为暴力性高能量损伤。由于MNSF受伤机制的复杂性,患者的临床表现不尽相同,导致其常发生漏诊或延迟诊断。目前,临床上对于MNSF发病率和损伤原因有很多报道,特别是其致伤机制,也存在很多理论。脊柱跳跃性骨折的治疗需全面考虑,如脊柱的不稳定性、畸形和骨折节段之间正常的椎体数目甚至患者想要减少住院时间的要求等。治疗时应按照各自损伤部位的情况决定治疗方案,强调个体化治疗。需要手术治疗的患者应依据其损伤特点选择相应术式,重建脊柱稳定性。本文主要就近年来MNSF的临床研究进展了进行总结,旨在为MNSF的临床诊疗提供参考。     

最短路径法在水稻ABA 和环境胁迫条件下基因应答网络研究中的应用

目前微阵列数据分析方法都基于具有相似表达模式的基因可能具有相近的生物学功能这一假设, 而实际上参与同一生物学功能的基因, 在表达时间和空间上是有关联的, 而并非表现为相似模式。利用水稻cDNA微阵列, 对水稻在ABA及干旱、寒冷和高盐胁迫条件下的基因表达进行了研究。选取环境胁迫和ABA应答的相关基因, 采用最短路径法(shortest path), 利用自行编制的计算软件, 在表达模式不直接相关的基因之间构建最短路径。研究表明, 通过分析这些基因的表达数据, 可以发现它们在功能上的关联性, 并对未知基因的功能预测进行了探索, 为构建水稻在ABA和环境胁迫条件下的分子应答网络奠定了基础。     

最短路径法在水稻ABA和环境胁迫条件下基因应答网络研究中的应用

目前微阵列数据分析方法都基于具有相似表达模式的基因可能具有相近的生物学功能这一假设,而实际上参与同一生物学功能的基因,在表达时间和空间上是有关联的,而并非表现为相似模式。利用水稻cDNA微阵列,对水稻在ABA及干旱、寒冷和高盐胁迫条件下的基因表达进行了研究。选取环境胁迫和ABA应答的相关基因,采用最短路径法(shortest path),利用自行编制的计算软件,在表达模式不直接相关的基因之间构建最短路径。研究表明,通过分析这些基因的表达数据,可以发现它们在功能上的关联性,并对未知基因的功能预测进行了探索,为构建水稻在ABA和环境胁迫条件下的分子应答网络奠定了基础。     

靶向前列腺癌CAR-NK细胞的抗肿瘤活性评价

目的：探索基于DAP12共刺激信号和靶向前列腺干细胞抗原(PSCA)的嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK)对前列腺肿瘤细胞的杀伤作用。方法：使用慢病毒转染系统构建CAR-NK细胞,使用流式细胞术检测前列腺癌细胞DU145 PSCA的表达水平和CAR-NK细胞的阳性率,并经细胞和动物模型评价CAR-NK细胞的抗肿瘤活性。结果：前列腺癌细胞DU145高表达PSCA,阳性率约为98.50%。流式细胞术检测显示CAR-NK细胞CAR分子表达阳性率为(64.07±3.01)%。细胞毒性实验发现,与对照NK细胞相比,携带DAP12共刺激信号的CAR-NK细胞具有较强抗前列腺肿瘤作用,杀伤率提升了约1.5倍。ELISA结果显示,与对照NK细胞相比,CAR-NK细胞杀伤DU145细胞时释放的TNF-α、IFN-γ、CD107α、Granzyme B和Perforin-1等因子水平显著提高。动物实验表明,CAR-NK细胞相对于对照NK细胞,更能有效抑制肿瘤增殖,两者之间有显著性统计学差异(P<0.000 1)。结论：靶向PSCA并提供DAP12共刺激信号的CAR-NK细胞具有较强杀伤前列腺肿瘤的作...     

医学影像科检查在医保总额预付改革政策下的变化

目的 探讨医保制对医院影像科检查量的影响以及应对的方法。 方法 对北京大学肿瘤医院医学影像科2012年度全年检查量数据进行统计分析,组间率的比较采用χ²检验或Fisher精确概率法。 结果 医保总额预付制前后放射科检查量总体情况变化不大。非医保群体中,各种检查的构成比情况变化不大。结论 医保总额预付制使医保病例的影像检查手段构成发生了积极变化,减少了病人的医疗支出,促进医疗资源的优化配置;放射科应针对变化采取相应措施,以保证临床医疗和科研工作的平稳开展。     

PSCA-HSP70融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化

旨在大肠杆菌中表达PSCA-HSPT0融合蛋白,并对其进行纯化.克隆人PSCA基因及HSP70基因,构建表达PSCA-HSP融合蛋白的工程菌,优化表达及纯化条件,对重组蛋白进行纯化.结果表明,成功构建重组表达质粒PSCA-HSP,重组蛋白得到可溶性表达,优化纯化条件后获得90%以上纯度的重组蛋白.本研究成功实现了PSCA与HSP的融合表达,为下一步肿瘤疫苗的研制奠定基础.