皱纹盘鲍伴侣蛋白CCTζ的分子克隆及其在不同锌含量日粮处理下的表达分析

伴侣蛋白CCT在蛋白折叠、抗胁迫以及调节细胞生长等生理过程中担负重要作用。研究利用同源克隆和RACE技术克隆了皱纹盘鲍伴侣蛋白CCTζ(HdhCCTζ)cDNA全长序列,并对CCTζ基因的序列特征进行了分析。HdhCCTζcDNA序列长1960 bp,开放阅读框为1599 bp,编码532个氨基酸,生物学软件推测其编码蛋白相对分子量为58.46 kD,等电点为6.53。BLAST分析结果表明HdhCCTζ与哺乳动物、鸟和鱼类等物种的CCT具有较高的同源性。生物信息学分析结果显示,HdhCCTζ蛋白序列中包含3个典型的CCT信号基序(35RTNLGPKGTLKML47,56LTKDGNVLLHEMQIQHP72和84QDDITGDGT92)以及1个腺苷三磷酸结合基序(89GDGTTS94)。此外,在HdhCCTζ蛋白序列中还包含3个糖基化位点(23NISA26,128NKSL131and234NVSL237)。实时荧光定量PCR检测结果显示,HdhCCTζ在皱纹盘鲍组织中为组成型表达,但主要集中在性腺、血淋巴和肝胰腺中表达。使用不同锌含量(6.69 mg/kg、33.85 mg/kg、710.63 mg/kg和3462.5 mg/kg)的日粮来饲喂幼鲍20周后,取其肝脏和血细胞总RNA,利用实时荧光定量PCR技术进行HdhCCTζmRNA的表达水平分析。分析结果显示,随着日粮中锌含量的增加,HdhCCTζmRNA在血淋巴和肝胰腺中的表达水平呈现上调的趋势。相比于锌适量组(33.85 mg/kg),过量的锌(3462.5 mg/kg)却能够下调HdhCCTζmRNA的表达水平。上述结果表明,HdhCCTζ的表达受到日粮中锌添加量的影响,而高表达量的HdhCCTζ可能在提高皱纹盘鲍机体抗胁迫过程中发挥重要作用。     

鸡胚睾丸支持细胞的分离、纯化与鉴定

以18天鸡胚睾丸为实验材料,经胶原酶和胰蛋白酶两步酶消化法得到生精上皮细胞悬液.在原代培养过程中经差异贴壁和低渗处理后,获得了纯度约为90%的单层支持细胞.对纯化的培养物染色鉴定,结果显示支持细胞为碱性磷酸酶(AKP)阴性,而混杂在其中的另一种体细胞管周细胞为AKP阳性;油红O染色显示,支持细胞胞质内含有大量的脂肪滴,核内见双极小体;吖啶橙染色证实支持细胞富含RNA;罗丹明123染色显示支持细胞富含线粒体;Hoechst 33342染色显示支持细胞细胞核呈长卵圆形,核的长轴与细胞长轴平行;免疫荧光染色显示支持细胞胞质中表达波形蛋白.建立了一套简单、易行的鸡胚睾丸支持细胞分离纯化与鉴定方法.     

EGFP-LacZ双报告基因真核表达载体的构建及体外表达

构建(β-半乳糖苷酶与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)双报告基因的真核表达载体,并在真核细胞中表达。采用PCR方法从质粒pLenti6/V5-GW/LacZ 中获取LacZ全基因,与pEGFP-C1重组后构建真核表达载体pEGFP-C1-LacZ。该重组质粒经PCR和酶切方法鉴定后,在脂质体介导下转染293FT细胞株及鸡胚成纤维细胞,通过荧光观察和组织化学方法检测Egfp和LacZ基因的表达。结果表明,LacZ基因被克隆到pEGFP-C1,成功构建了双报告基因真核表达载体。该重组质粒转染后的细胞呈现绿色荧光,组织化学方法检测到呈蓝色的细胞,表明两个报告基因均能在细胞内正确表达。     

鸡垂体前叶提取物诱导鸡超数排卵

Chicken anterior pituitary extract(CAPE) and acetone dried chicken anterior pituitary (ACAPE) were injected intraperitoneally into normal laying hens (‘ovulation suppressed’ following pretreatment with daily subcutaneous injection of PMSG) to induce multiple ovulations. The dose of PMSG, the effect of CAPE and ACAPE and the time required for induction of ovulation following injection of ovulation inducing hormone were determined. The results revealed that (1) when 75 IU PMSG was administered daily, egg laying stopped in 33% of the treated hens within 6 days after the first injection. However, the percentage of hens showing the same effects changed significantly (over 95%) within 3 to 6 days when the amount of PMSG was increased to 100 IU; (2) the number of ovulated ova was 1 00±0 00, 2 33±0 26,2 20±0 20 respectively after receiving 100 mg, 200 mg and 300 mg; the number of ovulated ova was 2 00±0 00, 2 86±0 48, 3 00±1 50 respectively after receiving 10 mg, 15 mg and 20 mg ACAPE; (3) The time from injection to ovulation in almost all hens was about 7 5 h except one hen ovulated about 6 5 h after receiving ACAPE .     

抗病毒基因MxA真核表达载体的构建及在鸡细胞中的表达

将人抗病毒蛋白基因MxA与携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达质粒重组后构建MxA基因真核表达载体pEGFP-C1-MxA.经PCR和酶切方法鉴定后,重组质粒在脂质体介导下转染鸡成纤维细胞和睾丸组织原代细胞,通过荧光观察,RT-PCR及细胞免疫组化检测目的基因的表达.结果表明,MxA基因片段已经被克隆到pEGFP-C1表达载体,成功构建了MxA基因真核表达载体pEGFP-C1-MxA.经该重组质粒转染后的鸡细胞的胞质中呈现颗粒状分布的绿色荧光,RT-PCR扩增出EGFP和MxA基因的特异性片断,免疫组化结果显示EGFP报告基因在细胞内的阳性表达,并表现出MxA的表达特征,间接证明了MxA可在鸡细胞中表达.MxA基因真核表达载体的成功构建以及在鸡细胞中的表达为进一步研究MxA基因在抗禽病毒性疾病中的应用打下了基础.     

中华绒螯蟹幼蟹对亮氨酸和异亮氨酸的需要量

以初始体重为(0.900.02) g的中华绒螯蟹幼蟹为试验对象, 采用酪蛋白、明胶、进口鱼粉和晶体氨基酸为蛋白源, 配制成12组试验饲料, 研究中华绒螯蟹幼蟹对亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)的需要量。饲料中Leu水平为0.87%、1.26%、1.64%、2.03%、2.39%和2.81% (分别记为Leu-1Leu-6组), Ile水平为0.69%、1.21%、1.70%、2.19%、2.70%和3.21% (分别记为Ile-1Ile-6组)。试验周期为60d。结果表明: (1)饲料中Leu含量为2.39%时, 幼蟹特定生长率和全蟹粗蛋白含量达到最大值, 而各组之间的成活率和全蟹水分、粗脂肪以及灰分无显著差异(P 0.05)。当饲料Leu含量大于2.39%时, 河蟹肌肉Leu含量、肌肉必需氨基酸总量和肌肉氨基酸总量均显著高于其他各试验组(P 0.05)。(2)饲料中Ile含量为2.19%时, 幼蟹特定生长率和全蟹粗蛋白含量达到最大值, 而各试验组之间的成活率和全蟹水分、粗脂肪以及灰分差异不显著(P 0.05)。河蟹肌肉Ile含量、必需氨基酸总量和氨基酸总量随饲料中Ile含量增加呈先升高后降低的趋势, 最大值均出现在Ile-5组(2.70% Ile), 但Ile-4组(2.19% Ile)与Ile-5组差异不显著(P 0.05)。根据特定生长率与饲料Leu或Ile水平的折线模型, 确定中华绒螯蟹幼蟹饲料亮氨酸和异亮氨酸的适宜需要量分别为饲料干物质的2.36%和2.25%, 即饲料蛋白的5.88%和5.72%。