Kil蛋白介导的大肠杆菌外泌表达系统

利用大肠杆菌素释放基因（kil)能有效地增加细菌外膜通透性促进周质蛋白外源的原理构建了含kil基因的大肠杆菌外泌表达系统,将大肠杆菌本身的周质分泌蛋白β-内酰胺酶和异源周质分泌蛋白点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶作为报告蛋白,观察Kil蛋白对这两种通常极少分泌到胞外的周质蛋白胞外分泌的促进作用,我们的研究显示：kil基因表达时,β-内酰胺酶的总活性较对照组提高1倍,胞外分泌活性较对照组提高近4倍,脯氨酰内肽酶的总活性较对照组提高0.8倍,胞外分泌活性较对照组提高3倍。     

酵母双杂交检测C17orf25蛋白与ADP-核糖焦磷酸水解酶NUDT9的相互作用

通过RACEPCR的方法从肝组织中分离得到C17orf2 5基因。利用酵母双杂交的方法以C17orf2 5为结合结构域筛选人HeLacDNA文库分离得到nudt9基因。NUDT9是一种焦磷酸酶 ,可以将ADP 核糖水解成AMP和核糖 5 磷酸。在大肠杆菌中直接表达了C17orf2 5蛋白、6×His tag与NUDT9的融合蛋白质 ,两者均以包涵体形式存在。蛋白质条带割胶纯化 ,并复性。之后的NTA Ni2 亲和柱层析实验表明这两种蛋白质在体外相互作用。将C17orf2 5与绿色荧光蛋白基因在SMMC772 1中融合表达 ,结果表明C17orf2 5蛋白可能定位在线粒体中 ,侧面印证了在细胞内与NUDT9作用的空间可能性。ADP 核糖在体内具有重要的生理作用 ,在细胞内的累积对细胞生长不利 ;同时 ,ADP 核糖化是一种重要的蛋白质修饰方式 ,与多种细胞凋亡的发生有关。因此从实验结果可以判断 ,C17orf2 5对细胞生长的抑制作用可能通过与NUDT9的相互作用来实现     

脂肪组织特异表达的脂连蛋白（Adiponectin）及其球状区的克隆表达及体内活性的检测

3T3 L1脂肪细胞特异分泌一分子量约为 30kD的蛋白质 ,命名为ACRP30。ACRP30只在分化后的脂肪细胞中表达 ,在对胰岛素敏感度不一样的老鼠模型中 ,降低ACRP30的表达与胰岛素不敏感有关。为了研究人ACRP30同源基因 ,运用RT PCR方法分别克隆了脂连蛋白和球状区脂连蛋白 (脂连蛋白的C端球状区域 )基因 ,并在大肠杆菌中获得了融合表达。用融合球状区脂连蛋白蛋白免疫新西兰兔 ,得到了滴度为 1 0 0 0 0的多克隆抗体。用Western印迹方法检测到了人血液中一种能与该抗体作用的大小约为 38kD的蛋白质 ,此蛋白质也能被抗ACRP30的抗体检测到。单一注射融合脂连蛋白或者球状区脂连蛋白能显著降低糖尿病大鼠的血糖浓度 ,这些结果提示重组的脂连蛋白和球状区脂连蛋白具有生物学活性 ,为脂连蛋白的功能研究打下了一定的基础     

人睫状神经营养因子在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达和生物活性测定

The recombinant human ciliary neurotrophi factor(hCNTF)expressed in E.coli aggregatedas inclusion bodies and refolding procedure was necessary to obtine the active protein.To overcome the disadvantage,we cloned hcntf gene into yeast expression plasmid pPIC9K and collected the plasmid pPIC9K-hcntf.Plasmid pPIC9K-hcntf was transformed into yeast Pichia pastoris GS115,and screened on G418-SD plates.The transformants with high copies of hcntf gene were inoculated into BMMY media and induced with 0.5% methanol.The recombinant hCNTF was secreted into the media.The amount of hCNTF in the supernatant was about 10 mg/L when incubated in the conical flasks and reached up to 60 mg/L under fed-batch condition in 15 L fermentator.The recombinant hCNTF expressed in E.coli was renatured as the control.The neonatal rat dorsal root ganglion assay showed that proteins expressed in both systems have the activity of promoting the growth of neuron axons.The phenomenon can be observed with only 3 μg hCNTF expressed in yeast present,which indicates that hCNTF was successfully expressed in Pichia pastoris and has a relatively high activity.