中华鳖白细胞介素21基因cDNA克隆及生物信息学分析

目的:从中华鳖脾脏、肝脏、肠道构建的SMARTer cDNA文库中克隆中华鳖白细胞介素21(IL-21)基因的cDNA。方法:采用cDNA末端快速扩增(RACE)法克隆中华鳖IL-21基因cDNA序列,并利用生物学软件进行生物信息学分析。结果:中华鳖IL-21 cDNA长874 bp,其编码产物包含135个氨基酸残基,二级结构主要包括α螺旋、延伸链、无规则卷曲和β转角,三级结构包括信号肽和IL-15结构域。系统进化分析表明其与鸟类首先聚类,其次为哺乳类。以人IL-21为模型,构建了中华鳖IL-21的3D结构模型。结论:从生物信息学分析可知我们所获序列为中华鳖IL-21 cDNA,为深入研究中华鳖IL-21及相关通路奠定了基础。     

镉胁迫对河南华溪蟹两种C型凝集素免疫应答的影响

C型凝集素是一类可以和糖类结合的蛋白质, 是先天性免疫系统中重要的模式识别受体。其中, 经典C型凝集素依赖Ca2+对糖类进行识别。Ca2+可作为细胞内第二信使, 参与多种信息传递。而重金属镉可导致细胞钙稳态失调, 干扰细胞内与Ca2+相关的信息传递。研究旨在探明镉胁迫对河南华溪蟹(Sinopotamon henanense) ShLec21和ShLec23两种C型凝集素免疫应答的影响。利用RACE方法, 克隆了ShLec21和ShLec23, 并进行了系统进化分析; 利用实时荧光定量PCR的方法, 研究了ShLec21和ShLec23的组织表达模式和镉联合嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)胁迫后肝胰腺和血淋巴中ShLec21和ShLec23表达模式。结果显示: ShLec21 cDNA全长863 bp, 编码152个氨基酸残基; ShLec23 cDNA全长681 bp, 编码164个氨基酸残基。ShLec21和ShLec23分别聚类为无脊椎动物的两个分支。ShLec21和ShLec23在血淋巴、鳃、肝胰腺、肠道、肌肉、卵巢和精巢中表达广泛, 但二者均主要在肝胰腺中表达。在胁迫条件下, 单独镉胁迫对肝胰腺和血淋巴中ShLec21和ShLec23表达量无显著影响; 在单独嗜水气单胞菌感染后, 肝胰腺中ShLec21和ShLec23表达量分别显著(P<0.05)与极显著(P<0.01)下调, 血淋巴中ShLec23表达量显著(P<0.05)下调; 而在镉胁迫后嗜水气单胞菌感染过程中,ShLec21和ShLec23表达量在肝胰腺和血淋巴中显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)上调。研究结果表明, 河南华溪蟹ShLec21和ShLec23在响应嗜水气单胞菌感染过程中的表达, 在一定程度上能够被镉胁迫所上调。     

急性冷胁迫对中华鳖幼鳖肠道黏膜组织的影响

为了探究急性冷胁迫对中华鳖(Pelodiscus sinensis)幼鳖肠道不同区段黏膜组织学特征的影响, 实验检测了急性冷胁迫前后血清二胺氧化酶(Diamine oxidase, DAO)的活性, 同时观察了急性冷胁迫前后中华鳖肠道黏膜的相关组织形态的差异。DAO活性显示: (1)在第一次急性冷胁迫实验中, 中华鳖血清DAO活性随急性冷胁迫时间的增加而呈现降低趋势, 并在冷胁迫到达48h降到了最低水平; (2)在急性冷胁迫及复温实验中, 中华鳖血清DAO的活性, 在冷胁迫3d后显著降低, 但随着温度的恢复, DAO活性又恢复到正常水平。组织病理结果显示: (1)急性冷胁迫对中华鳖肠道(回肠后段和大肠)黏膜上皮的形态没有明显影响; (2)急性冷胁迫对回肠后段的杯状细胞数目、肠绒毛长度和绒毛长度/隐窝深度的比值没有显著影响, 但会使回肠后段黏膜厚度显著降低; (3)急性冷胁迫会使大肠的杯状细胞数目降低。这表明急性冷胁迫会改变中华鳖肠道黏膜的结构, 但在不同的肠段, 这种改变是不同的。回肠后段和大肠在同样的冷胁迫方式下黏膜机械屏障的不同变化情况, 提示中华鳖肠道各段对急性冷胁迫具有特殊的应对方式。     

基于密码子优化策略的斑马鱼FOXP3A分子的原核表达及多克隆抗血清制备

目的:构建斑马鱼FOXP3A融合蛋白的原核表达系统,诱导表达并制备多克隆抗血清。方法:选取斑马鱼foxp3a基因cDNA的894 bp特异区段(s-foxp3a),对该片段进行密码子优化后构建原核表达载体pET-32a-s-foxp3a,转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达斑马鱼S-FOXP3A-His融合蛋白并纯化,纯化后的蛋白免疫家兔,制备斑马鱼FOXP3A蛋白的多克隆抗血清,4次免疫后取血清,采用间接ELISA法检测抗血清效价。结果:在16℃经0.5 mmol/LIPTG诱导10 h的条件下,SDS-PAGE分析表明斑马鱼S-FOXP3A-His融合蛋白以包涵体形式产生;间接ELISA检测结果显示,FOXP3A蛋白多克隆抗血清的效价在1.6×10~5以上。结论:制备了高效价的斑马鱼FOXP3A多克隆抗血清,为进一步解析斑马鱼FOXP3A蛋白的功能提供了基础工具。     

外源维生素C及冬眠对中华鳖稚鳖生长、维生素C合成和肝脏维生素C含量的影响

本文研究了饲料中维生素C(Vc)对中华鳖稚鳖冬眠前后Vc合成能力及肝脏中Vc含量的影响。将体重为29.41g±5.44g的稚鳖180只,按其饲料中Vc含量(0、500、2500mgVc/kg饲料)分为Vc0、Vc500和Vc2500共3组,每组6个平行,每平行10只鳖。实验开始前称重得各组初始平均体重。25℃±1℃下用实验饲料饲喂4周后,缓慢降温至7℃,人工诱导其进入冬眠,此时为冬眠期开始,每组取6只鳖,称重后快速处死,取其肝脏和肾脏。其余鳖全部称重。冬眠8周末取样,处理同上。用高效液相色谱(HPLC)法测定肝脏Vc含量和肝脏、肾脏古洛糖酸内酯氧化酶(GLO)活力。结果发现中华鳖自身能够合成Vc,且合成部位在肾脏。饲喂4周不同Vc水平的饲料后,各组间特定生长率差异不显著。冬眠8周后,各组体重均有所降低,组间冬眠期间特定生长率无显著性差异。冬眠开始时,稚鳖肝脏Vc蓄积量有随外源Vc浓度升高而递增的趋势,但差异未达到显著性水平;经历冬眠后各组稚鳖肝脏Vc含量降低,Vc500组下降不显著,而Vc0与Vc2500组显著下降;肾脏GLO活力在不同Vc梯度组间及冬眠前后均无显著差异。以上结果表明:中华鳖冬眠过程中要消耗较多的肝脏Vc,外源Vc和冬眠对肾脏Vc合成能力影响不显著。