“掌握性学习”简介

为了介绍“掌握学习法”,本刊本期发表了“初中动物学单元目标教学实验”和“动物学单元教育目标及单元目标检测题的设计示例”两篇文章,并编译了本文,以便读者能从理论上和实际教学方法上对“掌握性学习”的基本内容有一概括性的了解。     

代谢工程改造大肠杆菌一碳模块高效合成L-甲硫氨酸

L-甲硫氨酸又名L-蛋氨酸,是人体必需8种氨基酸之一,在饲料、医药、食品领域具有重要应用。以实验室前期构建的M2(Escherichia coli W3110?IJAHFEBC/PAM)为出发菌株,以模块化代谢工程策略构建了一株L-甲硫氨酸高产菌株。首先通过过表达亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MetF)和筛选不同来源的丝氨酸羟甲基转移酶(hydroxymethyltransferase,GlyA),增强了一碳模块甲基供体的生成,优化了一碳模块。随后针对一碳模块的前体供应,过表达了胱醚裂解酶(cysteamine lyase,MalY)和半胱氨酸内运基因(fliY),有效地提高了L-高半胱氨酸和L-半胱氨酸的供应。最终摇瓶发酵L-甲硫氨酸的产量由2.8 g/L提高至4.05 g/L,5 L发酵罐中达到18.26 g/L。研究结果表明,一碳模块对L-甲硫氨酸的生物合成具有十分重要的影响,在细胞内通过优化一碳模块,可以实现L-甲硫氨酸的高效生物合成。本研究为进一步提高微生物发酵生产L-甲硫氨酸的水平奠定了基础。     

四膜虫(Tetrahymena shanghaiensis)大核核仁与去膜大核能诱导非细胞体系核重建

外源DNA或染色质在非洲爪蟾卵提取物中可以诱导细胞核样结构的重建。重建核除不具有核仁样结构外,在其它形态结构上与真核细胞核十分相似。前人的工作表明在重建核中具有核仁前体结构。但可能是由于缺少活性核仁组织者的缘故,这些核仁前体不能相互融合形成新生核仁。那么活性核仁组织者在重建核中是否能发挥其功能呢?为了研究这一问题,我们提取纯化了四膜虫的大核与大核的周边核仁。进一步去除大核的核被膜,并将去除核被膜的大核与大核核仁分别加入非洲爪赡卵非细胞体系中。通过电镜超薄切片观察,我们发现无论是与大核染色质相连的周边核仁还是分离纯化的核仁结构在非洲爪赡卵非细胞体系中都不能保持其原有结构特征,而是发生了典型核重建变化,并且在诱导形成的重建核中也看不到核仁样结构。这些结果说明具有活性的核仁组织者在加入非洲爪蟾卵提取物后既不能继续保持其原有的RNA转录功能也不能诱导新的核仁的出现。     

非细胞体系核重建过程中两类膜泡在环形片层及核被膜形成中的作用

非洲爪蟾卵经钙离子载体Ａ２３１８７激活后,在１０,０００ｇ下离心得到爪蟾卵提取物,ＬａｍｂｄａＤＮＡ中入上述提取物可构建出染色质结构,并在染色质表面重建核被膜,同时,在染色质外的区域形成环形片层。核被膜在环形片层有相似的发生途径,它们都是由两类在形态、大小、膜结构上有明显差别的膜泡融合而来,首先是直径２００ｎｍ的圆形小膜泡相互融合成双层膜片层,同时核孔复合体在双层膜上大量装配;以这些双层膜片层为基     

高通量测序分析实验性脑脊髓炎肠道微生物变化及与IL-17、IFN-γ相关性

【目的】通过建立实验性脑脊髓膜炎(EAE)小鼠模型,观察小鼠肠道菌群在不同发病时间点的变化和炎症因子IL-17、IFN-γ的表达情况,探讨肠道菌群的变化在EAE发病中的免疫调节作用。【方法】将48只C57BL/6小鼠按照随机数字表法分为正常对照组、EAE模型组各24只。EAE组采用MOG35-55与完全弗氏佐剂的混合物制备模型,进行神经功能评分,记录体重变化。分别取免疫后7、14、21、30 d的小鼠粪便,对样本DNA的16S rDNA V3/V4区基因测序。ELASE法检测IL-17、IFN-γ的表达。【结果】EAE组小鼠血液中IL-17、IFN-γ的表达从第7天开始逐渐升高,21 d时达到高峰。14 d时,EAE组与正常对照组相比,物种丰度有显著性差异(P0.05)的菌种有:Alistipes、布牢特氏菌属、毛螺菌科_NK4A136_group等。30dEAE组与正常对照组相比,物种丰度有显著性差异(P0.05)的菌种有:Allobaculum、真细菌属、螺杆菌等。通过LefSe分析,在7、14、21 d中分别主要作用的微生物菌种逐渐减少,在21d时最少。Odoribacter在21d时起了主要作用。【结论】与正常对照组相比,14、21、30dEAE小鼠肠道菌种的丰度均发生了变化,产生了肠道菌群的紊乱;其中普雷沃氏菌属_NK3B31_group的丰度均较正常对照组降低,与IFN-γ呈负相关(r=–0.537,P0.01)。普雷沃氏菌属_NK3B31_group可能是导致MS脱髓鞘发生的关键菌属。EAE组各个时间点相比起主要作用的肠道菌群种类减少,多样性降低。其中,Odoribacter是在21 d高峰期起主要作用的菌种,但其作用机制需要深入研究。EAE组中炎症因子IL-17、IFN-γ表达的升高,促进了MOG35-55诱发的炎症反应。     

Mitotic Catastrophe的研究进展

细胞死亡是多细胞生物生命过程中重要的生理或病理现象,可分为坏死和程序性细胞死亡,而后者根据死亡细胞的形态学和发生机制的不同又可分为凋亡、自吞噬和mitotic catastrophe,其中mitotic catastrophe是近年来才被揭示报道,是指细胞在有丝分裂过程中死亡的现象,是一种发生在细胞有丝分裂期由于异常的细胞分裂而导致的细胞死亡,它常常伴随着细胞有丝分裂检查点的异常和基因或纺锤体结构的损伤而发生。现对mitotic catastrophe及相关的调控机制进行综述。     

乳糖酶研究进展

乳糖酶作为乳品添加剂,应用相当广泛,通过来源及其性质、基础研究和应用等方面对乳糖酶进行综述,重点介绍乳糖酶研究上的新进展和应用的新领域,由于近年来低温乳糖酶成为研究热点,特别对低温乳糖酶的研究进行介绍.     

shRNA随机文库结合TK自杀基因筛选靶向HIV-1LTR相关宿主因子

构建shRNA随机文库与HIV-1 LTR启动胸苷激酶基因(TK基因)稳定表达的稳定细胞系HEK293/TK,将两者结合起来,筛选靶向HIV-1 LTR相关宿主因子.方法:通过化学合成含有19个随机脱氧核苷酸的发夹结构,将其退火补平后与合成的接头Linker连接进行PCR反应,将PCR产物酶切后置于慢病毒载体pLenti-U6启动子下游由此构建shRNA随机文库;利用重叠PCR将HIV-1 LTR片段和TK基因连接起来,连接产物经酶切后与pcDNA3.1载体连接;将连接正确的质粒转染HEK293细胞同时用G418加压筛选获得稳定细胞系HEK293/TK;将所获得的文库质粒包装成慢病毒后侵染所构建的HEK293/TK细胞系,通过加入药物GCV进行加压筛选获得存活细胞.结果:成功筛选到加药后存活下来的细胞,抽提细胞基因组,采用巢式PCR扩增目的干扰序列并用Western blot对干扰序列进行验证,鉴定获得一个克隆所表达的shRNA能对TK基因的表达起到抑制作用,通过测序分析获得其干扰序列,该序列很有可能针对HIV-1 LTR某宿主相关因子.结论:成功构建了一种筛选HIV-1 LTR相关宿主因子的方法,筛选所得序列可以定位到具体相关宿主因子,为靶向筛选抗HIV-1药物提供了重要手段.     

从大容量噬菌体抗体库中筛选抗Acr蛋白人源单链抗体

目的:从天然的大容量噬菌体抗体库中筛选特异的抗结核分枝杆菌晶体蛋白( alpha-crystallin Acr)的人源抗体.方法:以结核分枝杆菌Acr蛋白包被免疫管,通过对噬菌体抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的过程从大容量抗体库中筛选特异性抗结核分枝杆菌Acr蛋白的抗体,并对可变区序列进行了测序分析.将特异性的噬菌体抗体感染HB2151菌,经IPTG诱导表达,制备了抗结核分枝杆菌Acr蛋白的可溶性单链抗体;对其序列和抗原结合活性进行分析鉴定.结果:经过4轮筛选,获得了43个与结核分枝杆菌Acr蛋白结合的阳性克隆,其中29个特异结合的克隆;测序分析有26不同的可变区片段;通过可溶性单链抗体(scFv)表达筛选到14株特异性结合Acr蛋白的可溶性单链抗体克隆;经过基因测序,分析了可变区基因的亚群.成功制备了可溶性单链抗体.Westren blotting分析证实筛选的人源单链抗体能与天然蛋白结合.结论:利用单链大容量抗体库获得抗结核分枝杆菌Acr蛋白的噬菌体抗体并且成功制备抗结核分枝杆菌Acr天然蛋白的可溶性单链抗体,为今后的研究和应用奠定基础.     

中下段胆管癌的预后影响因素分析*

目的:探讨中下段胆管癌的预后影响因素。方法:对79例中下段胆管癌患者的临床资料进行回顾性分析,采用Kaplan-Meier分析对确定的单因素进行生存率的描述,用Cox回归进行多因素分析,采用log-rank法对单因素进行生存分析评价。结果:79例患者1、3、5年生存率分别为70.2%,36.2%,19.1%,中位生存时间为19.8个月。行根治性手术患者1年、3年、5年生存率分别为87.9%、45.5%和24.2%,分别显著高于姑息性手术患者1年、3年、5年生存率(28.9%、14.3%和7.1%);行根治性手术患者的中位生存时间为34.5个月,较姑息性手术患者显著延长(8个月),根治术与姑息性手术1、3、5年生存率及中位生存时间比较四项均P<0.01,差异具有统计学意义。单因素分析显示肿瘤病理分化,慢性病史,淋巴结转移为影响中下段胆管癌预后的因素。多因素分析显示慢性病史、手术切缘、肿瘤病理分化程度是影响中下段胆管癌预后的独立危险因素。结论:慢性病史、手术切缘、肿瘤病理分化程度为中、下段胆管癌行切除术后预后的独立危险因素,根治性手术可提高中、下段胆管癌患者的生存率和延长其生存时间。