14-3-3参与apelin-13促进大鼠血管平滑肌细胞增殖ERK1/2信号途径研究

本室以前已经报道了G蛋白偶联受体APJ的内源性配体多肽,apelin-13,通过激活ERK1/2促进大鼠血管平滑肌细胞增殖.本文研究14-3-3信号蛋白是否参与apelin-13促进大鼠血管平滑肌细胞增殖ERK1/2信号途径,探讨apelin/APJ系统的细胞信号转导机制.组织贴块法培养大鼠胸主动脉VSMCs;Western blotting方法检测14-3-3、pRaf-1、Raf-1、pERK1/2、ERK1/2、cyclinD1、cyclinE的表达;MTT方法观察14-3-3抑制剂Difopein对VSMCs的增殖作用;免疫共沉淀方法检测14-3-3和Raf-1蛋白复合物的形成.Western blotting方法结果显示,apelin-13(0、0.5、1、2、4μmol/L)浓度依赖性刺激大鼠VSMCs 14-3-3表达、Raf-1和ERK1/2磷酸化,以2μmol/L最为明显;2μmol/L apelin-13时间依赖性刺激大鼠VSMCs 14-3-3表达、Raf-1和ERK1/2磷酸化,在4 h增加最为显著;14-3-3蛋白抑制剂Difopein明显抑制apelin-13诱导的Raf-1磷酸化、ERK1/2磷酸化、cyclinD1及cyclinE表达;免疫共沉淀方法发现apelin-13诱导14-3-3与Raf-1结合增加,而Difopein明显抑制两者结合;MTT法显示Difopein明显抑制apelin-13诱导的血管平滑肌细胞增殖.上述结果表明,Apelin-13通过14-3-3/Raf-1复合物-ERK1/2信号转导通路促进大鼠血管平滑肌细胞增殖.     

Daxx通过上调caveolin-1的表达介导Ox-LDL诱导巨噬细胞胆固醇蓄积和凋亡

为探讨Daxx对氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,Ox-LDL)诱导巨噬细胞胆固醇蓄积和凋亡的介导作用及其可能的分子机制,用高效液相色谱法检测细胞内胆固醇含量,油红O染色观察细胞内脂滴的形成情况,流式细胞术和吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色法研究Ox-LDL对细胞凋亡的影响,Real time RT-PCR检测细胞内Daxx mRNA的表达水平,Western blot检测caveolin-1蛋白的表达,用特异性siRNA沉默Daxx在RAW264.7 细胞中的表达．Ox-LDL上调Daxx mRNA和caveolin-1的表达、增加细胞内胆固醇含量、促使RAW264.7细胞凋亡,用特异性siRNA干扰Daxx在RAW264.7细胞中的表达能降低caveolin-1的表达、减少细胞内胆固醇含量、以及抑制细胞凋亡．上述结果表明,Daxx对Ox-LDL诱导RAW264.7巨噬细胞胆固醇蓄积和凋亡具有介导作用,这一作用可能与Daxx上调caveolin -1的表达有关．     

lncRNA在肿瘤中的表达及作用机制

长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一类转录本长度大于200 nt,不具有蛋白编码功能的非编码RNA.近年来,随着高通量测序技术的发展,越来越多的功能性lncRNAs逐渐被发现,且已成为研究的热点.研究发现,lncRNAs可以作为致癌或抑癌基因参与肿瘤的发生发展.通过比对肿瘤细胞和正常细胞的表达谱显示,多种lncRNAs在不同类型肿瘤中异常表达.除了表型上的研究,目前已有部分报道深入研究了lncRNAs在肿瘤中的作用机制.例如,lncRNAs与肿瘤细胞凋亡、转移及耐药等过程密切相关.此外,在肿瘤患者的临床常规检验中检测到lncRNAs,提示其能够作为一种潜在的肿瘤诊断和预后因子. lncRNAs有望成为新型肿瘤标志物和肿瘤治疗的靶点,用于诊断、治疗、预测预后.本文将通过对lncRNAs在肿瘤中的作用及其分子机制进行综述.     

重组人可溶性凝血酶调节蛋白对单核细胞源性泡沫细胞形成的影响

目的:研究可溶性凝血酶调节蛋白(Soluble thrombomodulin,sTM)结合的血浆低密度脂蛋白对细胞胆固醇代谢的影响,探索sTM参与或影响动脉粥样硬化发病过程的初步机制。方法:以THP-1巨噬细胞为模型,通过油红O染色、高效液相色谱检测胆固醇含量等方法,以体外重组人可溶性凝血酶调节蛋白结合的低密度脂蛋白(sTM-LDL)作用于巨噬细胞,观察sTM-LDL对细胞胆固醇代谢的影响。结果:研究发现:正常人LDL对细胞内胆固醇代谢影响较小;而sTM-LDL处理细胞72小时后,细胞内大量脂滴形成,细胞内胆固醇含量明显增多,符合典型泡沫细胞的特征;运用NH-1单抗中和／干扰sTM的作用,不能阻断sTM-LDL诱导的THP-1细胞内胆固醇聚集。结论:sTM对LDL的修饰可能改变了LDL的理化特性和代谢途径,可导致细胞内胆固醇聚集和泡沫细胞的形成,且这种作用与sTM本身对细胞的影响可能无明显关系。     

耐辐射球菌转录因子DdrO 的基因克隆与生物信息学分析

目的:克隆耐辐射球菌ddrO基因,并对其进行生物信息学分析,预测其功能。方法:根据耐辐射球菌ddrO基因序列,由Primer Premier 5设计一对引物,以提取的耐辐射球菌基因组为模板,PCR扩增获得耐辐射球菌ddrO基因,序列测定并利用生物信息学软件对ddrO基因的理化性质、高级结构及生物学功能等进行分析与预测。结果:成功获得了ddrO基因。生物信息学分析发现,ddrO基因核苷酸序列长度为396bp,编码一个131aa组成的相对分子质量为14.993kD的预测的DdrO转录因子。核酸同源性搜索及比较分析仅在与耐辐射球菌同属的Deinococcus geothermalis和Deinococcus deserti中发现高度相似的序列;蛋白同源性搜索发现一些与DdrO显著同源的蛋白,如Deide₂0570（95%）,Dgeo₀336（90%）,Deide₃p02170（82%）等;结构域分析发现DdrO含有HTH（helix-turn-helix）DNA结合结构域。结论:根据生物信息学结果预测DdrO蛋白可能具有转录调控作用,参与DNA修复和复制,在耐辐射球菌的DNA损伤修复过程中发挥一定作用。     

Daxx过表达对氧化应激诱导的肝肿瘤细胞凋亡的影响

死亡结构域相关蛋白Daxx可以敏化多种肿瘤细胞的凋亡过程,但对于肝肿瘤细胞株HepG2的影响未见报道．为了研究Daxx增加肝HepG2细胞对药物敏感性的影响及机制,为开发药物新的药理作用提供理论依据,分别转染pEGFP-C1和pEGFP-C1-Daxx这两个载体到HepG2细胞．实验分组如下：（1）正常对照组（未转染细胞组）;（2）pEGFP-C1空载体转染组（HepG2/GFP细胞）;（3）pEGFP-C1-Daxx表达载体转染组（nepG2/GFP-Daxx细胞）．筛选稳定细胞株,用逆转录聚合酶链反应检测mRNA的表达;用过氧化氢孵育24h诱导细胞凋亡,采用MTT法和流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot检测蛋白质的表达．经G418筛选稳定的细胞运用RT-PCR技术分析其mRNA,结果显示,转染绿色荧光蛋白Daxx表达载体的细胞Daxx的mRNA明显上调：用荧光显微镜观察到Daxx蛋白主要定位于细胞核．用过氧化氢诱导HepG2细胞凋亡,观察到过氧化氢呈浓度依赖性地抑制HepG2细胞活性．正常对照细胞、HepG2／GFP、HepG2／GFP-Daxx 3组细胞的IC50值分别是0．72、0．76、0．49mmol／L．并且运用流式细胞仪检测到HepG2／GFP-Daxx组细胞凋亡率明显高于转染空载体质粒组与未转染组（（42．9±8．42）vs（27．3±6．38）or（28．5±4．71））．提示HepG2/GFP-Daxx细胞对过氧化氢的反应性较未转染细胞和HepG2/GFP敏感．还运用Western-blot检测到活化的caspase3在Daxx转染组细胞表达最强,达到（204．66±19．68）％,而未转染和HepG2/GFP组细胞分别是（100±3．1）％、（107．39±20．1）％,进一步说明了Daxx可以增加HepG2细胞对于过氧化氢的敏感性．同时,观察到过氧化氢处理24h后,Daxx转染组细胞磷酸化的JNK表达明显高于空载体转染组和未转染细胞组．上述结果表明：a．Daxx可以增加肝HepG2细胞对过氧化氢诱导的细胞凋亡敏感性;b．Daxx蛋白敏化过氧化氢诱导的HepG2细胞凋亡可能与协同增加JNK活性有关．     

人FasL基因转染成熟树突状细胞对T淋巴细胞增殖和凋亡的影响

探讨转染人FasL基因的成熟树突状细胞(DC)对异体T淋巴细胞增殖和凋亡的影响,为实现临床器官移植免疫耐受提供初步实验依据.从健康成年人外周静脉血中获得成熟树突状细胞.将人FasL基因成功转染成熟树突状细胞,检测其表面分子的表达和自身凋亡情况,并对其抗原递呈功能进行分析.从异体健康成人外周血中获取T淋巴细胞,将转染成功的树突状细胞与T淋巴细胞混合培养,检测其对T淋巴细胞增殖和凋亡的影响.结果表明:人FasL基因转染没有明显影响成熟树突状细胞表面分子CD40、CD80、CD86和HLA-DR的表达;没有诱导树突状细胞自身发生凋亡;没有影响DC的抗原递呈功能.转染FasL基因后的树突状细胞使异体T淋巴细胞刺激指数明显下降,凋亡增加.因此认为,人FasL基因转染对成熟树突状细胞的表面分子表达、自身凋亡、抗原递呈等生物学性状无影响;转染FasL基因的树突状细胞使异体T淋巴细胞的增殖能力减弱,并能明显诱导T淋巴细胞凋亡.     

全膝关节置换术患者的护理概况

<正>随着我国人口老龄化的到来,膝关节疾病患者越来越多,而行全膝关节置换术患者也逐年增加。为使患者术后早期恢复患肢功能,提高生活质量,术前、术后的护理及功能康复训练尤为重要。胡艳君等[1]将膝关节置换术的整个护理过程分为术前、术后护理两部分。而杨晓霞等[2]则分为术前指导、术后护理和功能康复训练。张艳等[3]介绍美国护理专家Diem提出的护理模式:不按手术的阶段区分,而按病人的     

靶向WNT5A基因的shRNA逆转录病毒表达载体的构建与鉴定

目的:构建人WNT5A shRNA逆转录病毒表达载体.方法:根据人WNT5A基因mRNA序列设计并合成两条互补的DNA单链寡核苷酸,将退火后形成的双链连接于pSUPER Retro RNAi质粒,构建WNT5A shRNA逆转录病毒表达载体,经脂质体介导入GPG293细胞,包装成逆转录病毒.用该逆转录病毒感染人鼻咽癌细胞,Western blot法和RT-PCR检测细胞WNT5A的表达.结果:目的序列成功连接于载体并包装成逆转录病毒,免疫印迹检测和RT-PCR检测结果表明构建的WNT5A shRNA逆转录病毒表达载体能显著抑制鼻咽癌细胞WNT5A的表达.结论:成功构建人WNT5A shRNA逆转录病毒表达载体.     

高静水压培养对内皮酯酶表达的影响

探讨高静水压培养对内皮脂酶表达的影响及其机制．分大气压(0 mmHg)和高于1个标准大气压的递增压力(120、150、180 mmHg)培养人脐静脉内皮细胞,用蛋白酶体抑制剂MG132进行干预．RT-PCR检测内皮脂酶 mRNA的表达,间接免疫荧光技术和流式细胞术检测内皮脂酶蛋白的表达．结果显示,高静水压培养明显促进内皮脂酶mRNA和蛋白质的表达,180 mmHg培养24 h内皮脂酶mRNA的表达较对照组上调2.2倍(P < 0.001),内皮脂酶蛋白表达较对照组上调2.54倍(P < 0.001)．蛋白酶体抑制剂MG132干预明显抑制180 mmHg培养诱导的内皮脂酶 mRNA的表达,MG132干预组内皮脂酶mRNA表达约为180 mmHg培养组的50% (P < 0.05)．结果说明,高静水压上调内皮脂酶 mRNA和蛋白质的表达,其机制可能与核因子-κB活化有关．