耐热高活性荧光素酶在单细菌检测中的应用

[目的]开发活性和稳定性提高的荧光素酶突变体,建立单细菌检测方法。[方法]运用定点突变的方法,向荧光素酶LGR中逐步引入提高荧光素酶稳定性的氨基酸位点,构建荧光素酶突变体LGR-A215L、LGR-E354K和LGR-LK,并建立基于单细菌检测的快速无菌检查方法。[结果] LGR-A215L、LGR-E354K和LGR-LK的活性分别提高了9、26和140倍,45℃的稳定性提高了约2.9、1.3和2.7倍;此外,NaCl、培养基和生物制品溶液对LGR-LK的活性影响较小,活性变化在74%～181%之间。LGR-LK与ATP之间的亲和力显著提高,能灵敏的检测到小于10 CFU/mL菌悬液中的细菌,信号/背景值≥200;在48 h以内检测到TSB培养基中的金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌,相较于LGR的检测灵敏度提高了约1.5倍。[结论]开发了热稳定高活性荧光素酶突变体LGR-LK,其活性提高了140倍,45℃的热稳定性提高了2.7倍,并且其活性不受生物制品、NaCl和培养基的影响,能灵敏的快速检测单个细菌,可用于生物制品快速无菌检查。