人源Alu RNA工程菌的构建和表达

目的:外源RNA导入细胞特异性上调或下调基因表达,目前外源RNA的制备方法主要有化学合成、体外转录、细胞提取。Alu DNA和Alu RNA是人基因组和转录组中最重要的成分,参与基因表达调节。建立工程菌制备基因工程人源Alu RNA(Alu RNA)的技术,所提取的RNA满足一般生物学实验要求。方法和结果:将人Alu序列插入pET-28α质粒(pET),转化BL-21菌,探讨不同条件对Alu RNA产生的影响。用pET-Alu×8质粒转化BMBL-21(DE3)感受态细胞(简称DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导减弱细菌生长;用IPTG诱导2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h和16h,用Northern杂交检测Alu RNA的量,发现诱导4小时RNA产量最高;1、2、4、8、14拷贝的Alu序列插入pET,转化DE3菌,随拷贝数增加Alu RNA产量上升;pET-Alu×8 DE3菌液,不加IPTG诱导,没有Alu RNA产生,0.1~0.4mg/ml IPTG诱导时,Alu RNA产量没有区别,偏离该浓度时,RNA产量略下降;34℃、37℃和40℃培养pET-Alu×8 DE3菌液,IPTG诱导4h,在37℃培养条件下,RNA产量最高;将pET-Alu×8质粒转化3种BL-21感受态细胞,包括DE3、BMBL21-DE3-pLysS(简称pLysS)和Trans BL 21(简称TransBL),发现转化DE3感受态细胞后Alu RNA产量最高。结论:建立了基因工程制备Alu RNA的技术:pET-Alu×14质粒转化DE3菌,37℃培养至600nm OD为1.0时,加入终浓度为0.2mg/ml的IPTG诱导4h,获得最高Alu RNA产量,纯Alu RNA在提取的RNA中的含量达15.8%,每100ml菌液纯Alu RNA产量平均为0.46mg。