鸟分枝杆菌PPE25蛋白对THP-1巨噬细胞免疫效应的影响

[目的]探讨鸟分枝杆菌PPE25在调控人源THP-1巨噬细胞免疫应答反应中的作用及机制.[方法]通过基因扩增、载体构建、诱导表达、分离纯化等过程制备鸟分枝杆菌重组PPE25蛋白;将重组PPE25蛋白作用于THP-1巨噬细胞后,利用流式细胞术检测巨噬细胞凋亡率;运用ELISA方法检测细胞上清中TNF-α的浓度;采取Wes...     

鸟分枝杆菌中耐受表面活性物质相关基因的分离及功能鉴定

为筛选鸟分枝杆菌中耐受表面活性物质的基因并探究其相关功能,以认识鸟分枝杆菌适应肺部环境的杀(抑)菌机制,本研究构建鸟分枝杆菌基因组文库,采用生物活性水平筛选策略从基因组文库中筛选耐受十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)的克隆子,运用生物信息学分析该克隆子完整的开放阅读框及其编码蛋白的二级结构特点。将克隆子的全基因序列与pGEX-4T-3表达质粒连接后转化大肠杆菌,构建过表达目的蛋白的重组菌。检测重组菌分别在含SDS、H_2O_2、NaNO_2和GSNO条件环境下的存活率。结果表明成功构建滴度为1.18×10~4 cfu/mL的鸟分枝杆菌基因组文库,从文库中筛选到一个耐受SDS的基因MAV-4292。生物信息学分析显示,MAV-4292蛋白是一个无信号肽的跨膜蛋白,二级结构以α-螺旋为主。过表达MAV-4292重组菌在2%SDS、5 mmol/L H_2O_2、20 mmol/L NaNO_2和10 mmol/L GSNO体外条件下的存活率均比空载菌显著提高(p0.05)。结果表明,MAV-4292是鸟分枝杆菌中一个耐受表面活性物质的基因,它编码的蛋白参与了肺部表面活性物质、活性氧(reactive oxygen species, ROS)及活性氮(reaetive nitrogen species, RNS)的胁迫应答,是鸟分枝杆菌的毒力因子。