构建转CgA基因反向cDNA片段小鼠模型

为了制作CgA基因反义RNA转基因小鼠,构建了质粒pCAS2C,并把pCAS2C中完整的反义表达框显微注射入小鼠受精卵的雌原核中,随后将注射过DNA的受精卵移植入假孕鼠的输卵管中,假母所产子一低代都用p1和p4 引物对鼠尾基因组DNA进行PCR检测,选出2只首建鼠（PCR阳性）。首建鼠与正常鼠杂交后得到F1代小鼠,经PCR方法筛选出来的阳性F1代鼠雌雄自交产生F2代。为了检测F2代鼠的基因型,将PCR方法鉴定为阳性的F2代小鼠分别与正常小鼠回交,只有回交后所得后代PCR检测结果全为阳性的F2代个体才是转基因纯合鼠,这样分别得到两只转基因首建鼠的纯合个体。转基因小鼠脑总RNA经RT－PCR反应可产生300bp的产物,证明转基因小鼠中转入的反义基因已经转录,以上结果说明转入的pCAS2C反义表达框已经整合到转基因小鼠的基因组中并遗传给后代,而且已经转录。     

嗜铬颗粒蛋白A基因的反义转基因小鼠模型的建立及该基因启动子的组织特异性

构建小鼠嗜铬颗粒蛋白A（Chromogranin,A,CGA)基因的反义DNA载体pGAS1C－lacZ。用电穿孔的方法将该载体转化大鼠肾上腺髓质细胞瘤细胞系PC－12,X－Gal染色后证明位于CGA基因启动子下游的报告基因lacX已经表达。用限制性内切酶除去载体的质粒骨架后,显微注射入供体昆明小鼠的受精卵中,随后将注射过DNA的受精卵移植入假母的输卵管中,完成正常的胚胎发育。用PCR的方法筛选假母产下的小鼠,得到CGA基因反义RNA基因首建鼠14只。将首建鼠分别与正常昆明鼠交配,产生后代。取首建鼠的肾上腺进行X－Gal染色,组织用于石蜡切片,根据各鼠肾上腺切片的蓝色深浅判定转入基因量的高低,筛选到两只表达量高的首建鼠,留下它们的后代。取转基因鼠的各种组织用于X－Gal染色,发现报告基因在肾上腺、胰腺的胰岛中有表达,而在肌肉、脂肪组织中无表达,说明CGA基因的启动子具有神经内分泌组织特异性。