木瓜蛋白酶的研究——Ⅲ.组氨酸及色氨酸残基为木瓜蛋白酶表现催化活性的必需基团

(一)木瓜蛋白酶在甲烯蓝存在时照光数分钟活力即显著下降,光氧化过程中組氨酸及色氨酸的破坏和活力的下降均按一級反应进行。組氨酸和色氨酸破坏的一級反应常数之和恰等于活力下降的一級反应常数。过程中酪氨酸及二硫鍵含量无显著变化。(二)NBS作用于木瓜蛋白酶引起的色氨酸殘基的破坏与活力的下降完全一致。(三)根据光氧化及NBS的作用过程中木瓜蛋白酶活力下降与組氨酸及色氨酸破坏的定量关系,可以认为木瓜蛋白酶的必需基团中包含一个組氨酸及一个色氨酸殘基。     

木瓜蛋白酶的研究 Ⅱ.转酰基作用

本文提供以茚三酮法测受体α-氨基减少的方法以测定转肽反应。木瓜蛋白酶于50%甲醇,pH7.4左右条件下以CbZ-甘-NH_2,Cbz-白-NH_2及Cbz-丝-NH_2为供体,以甘-OEt为受体几乎只进行转肽作用而无供体本身的水解,但在30%丙酮溶液中却以水解反应为主。半胱氨酸、谷胱甘肽、氰化物、亚硫酸盐、[2,3]-二巯基丙醇及巯基乙酸皆可促进木瓜蛋白酶的转肽作用,但高浓度的[2,3]-二巯基丙醇及巯基乙酸与其他还原剂不同对转肽有抑制作用。转肽与水解的专一性不完全相同,如以Cbz-甘-NH_2,Cbz-丝-NH_2及Cbz-白-NH_2做供体时,几乎只进行转肽而无供体水解,但以Bz-精-NH_2及Cbz-谷NH_2-NH_2为供体时都无转肽作用。受体以氨基酸或肽的酯或酰胺为最好,酪氨酸乙酯不能做为转肽反应的受体。以Cbz-甘-NH_2,甘-OEt为供受体时底物浓度对反应速度的影响指出,受体与酶的结合远较供体紧密。甘-OEt的存在使木瓜蛋白酶于250mμ处光吸收有显著降低,并且对木瓜蛋白酶于甲醇溶液中的失活具有保护作用,说明受体与酶系专一性的结合。对本文实验结果的意义进行了讨论。     

木瓜蛋白酶的研究 Ⅴ.活性中心的C~(14)-标记

木瓜蛋白酶与不同当量的1-C~(14)-溴代乙酸作用結果,后者虽远为过量时亦只有半当量与每克分子酶結合(假定酶分子量为21,000)。C~(14)-羧甲基木瓜蛋白酶氨基酸图譜的放射自显影中仅发現一个被标記了的衍生物,可能是羧甲基組氨酸。看来活性中心组氨酸殘基与溴代乙酸的反应速度远远大于其他可能与溴代乙酸結合的基团,初步計算結果表明反应速度常数比至少在八百万倍以上。     

木瓜蛋白酶的研究 Ⅵ.白氨酰胺的聚合作用

木瓜蛋白酶于pH7在半胱氨酸存在下能催化白氨酰胺生成聚白氨酸,聚合物分子量約为1,200,过程中只有聚合作用并无白氨酰胺的水解。当反应系統中同时有苯丙氨酸甲酯存在时則生成白氨酸与苯丙氨酸之比为1∶1的,分子量約为1,400的共聚物。虽然从酶制剂的均一性,离子交換柱层析时活力的平行分布以及溴代乙酸的抑制看来,轉酰基反应和水解反应一样都是由木瓜蛋白酶所催化的,但根据白氨酰胺与苯甲酰精氨酰胺同时存在时的总反应速度为二者在相同条件下分別作用速度之和,催化白氨酰胺聚合的pK_b为5.3与苯甲酰精氨酰胺水解的pK_b值(3.3)显著不同,以及N-溴代琥珀酰亚胺对水解和聚合作用的影响也不相同等看来,木瓜蛋白酶催化水解与聚合作用的活性中心很可能不完全相同。     

木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶的研究——ⅥⅠ.无花果蛋白酶对不同底物的作用

观察无花果蛋白酶对一些合成底物作用的结果,说明酶的专一性和木瓜蛋白酶相似。它的特点是在pH7.4对白-NH_2的作用速度此对Bz-精-NH_2水解速度还快,并且在一定条件下只有白-NH_2的聚合反应而无供体的水解。酶作用于白-NH_2及Bz-精-NH_2共同存在时的反应速度也和木瓜蛋白酶相似,为在相同条件下分别作用于二者的速度之和。但从对氯汞苯甲酸和溴代乙酸的抑制看来,这两种活力是由同一酶所催化,可能酶对于二种反应的活性中心不完全相同。     

牛脾酶制剂催化从白氨酰胺生成聚白氨酸的作用

(1)牛脾酶制剂于pH 7.8及半胱氨酸存在下,具有明显的催化从白氨酰胺生成聚白氨酸的作用。聚合物約含13～15个白氨酸。(2)根据溴代乙酸的抑制,不同底物的共同作用,以及温度的影响,看来上述反应和组織蛋白酶A,B,C等无关,可能是由一个新的酶所催化。     

蛋白质功能基团的改变与其生物活力的关系 Ⅲ.对硝基苯酰甲基溴对某些蛋白质活力的影响

对-硝基苯酰甲基溴(NPAB)在不太高的浓度之下对木瓜蛋白酶,核糖核酸酶,胰凝乳蛋白酶和胰島素等的生物活力有明显的抑制作用。当NPAB与胰島素或胰疑乳蛋白酶共同保温时,随着生物活力的下降也同时发生吸收光譜的变化。对于胰凝乳蛋白酶而言,355mμ光密度的增加与其活力的下降完全平行說明NPAB仅作用于一个必需基团,再从二氫肉桂酸对这一抑制作用的?た蠢?这一基团可能是酶活性中心的一部分。NPAB对胰島素及核糖核酸酶的作用受pH影响,說明这一反应受蛋白分手中解离基团的控制,并且从它的pK值看来,这一解离基团很可能是组氨酸的咪唑基。pH影响木瓜蛋白酶和胰疑乳蛋白酶与NPAB的作用較为复杂,可能有不只一种解离基团参与控制它們与NPAB的反应。     

木瓜蛋白酶的研究 Ⅰ.对不同底物水解作用的比较

(一)氢离子浓度对木瓜蛋白酶水解不同合成底物的影响均属于非竞争性类型,即对不同底物的米氏常数皆与pH无关,pH仅影响最大反应速度。因此很可能木瓜蛋白酶的米氏常数即等于其与底物结合的解离常数。(二)甲醇对木瓜蛋白酶水解Bz-精-NH_2及Cbz-谷NH_2-NH_2有抑制作用,但对Cbz-白-NH_2及Cbz-甘-NH_2的水解却有显著的促进作用。(三)甘氨酸乙酯对Bz-精-NH_2及Cbz-甘-NH_2的水解亦有促进作用,但活力提高的程度各不相同。(四)根据以上结果对木瓜蛋白酶的作用机制作了简短的讨论。     

木瓜蛋白酶的研究 Ⅳ.活性中心组氨酸残基的羧甲基化

(1)在过量半胱氨酸存在下微量溴代乙酸或碘代乙酸在pH5对木瓜蛋白酶有強烈的抑制作用,当抑制剂与酶的克分子比为0.5时,抑制即达完全。抑制前后木瓜蛋白酶巯基含量不变。溴代乙酸作用后所得到的羧甲基木瓜蛋白酶汞盐結晶,与木瓜蛋白酶汞盐結晶相同。(2)在6M尿素溶液中溴代乙酸与木瓜蛋白酶的作用速度显著降低,底物L-白氨酰胺及抑制剂对氯汞苯甲酸都具有保护作用。这些事实表明溴代乙酸的抑制与木瓜蛋白酶的催化活性有密切关系,其作用点很可能是活性中心所在。(3)以双相电泳层析进行氨基酸組成分析結果指出,溴代乙酸作用点很可能是組氨酸殘基。