芽孢杆菌质体的研究I．短小芽孢杆菌质体的分离和鉴定

短小芽孢杆菌AS 1.326带有“杀死活性”质体。用琼脂糖—溴化胺乙苯菲啶凝胶电泳方法鉴别出质体带,用电镜方法观察到环状DNA分子,用溴化胺乙苯菲啶消除“杀死活性”质体试验及测定AS1.326菌Kill+表型试验证明AS 1.326菌带有pBP 3“杀死活性”功能的质体。     

体外建成带有λ噬菌体DNA片段的重组质体

将大肠杆菌抗四环素及抗氨苄青霉素的质体pBR322的DNA、大肠杆菌λ噬菌体DNA在体外经限制性核酸内切酶Hin d Ⅲ切割,并用T4DNA连接酶连接后,以大肠杆菌K 12 HB 101(recA~- r_k~- m_k~-)为受体进行转化,采用插入钝化(insertional inactivation)方法选择重组质体。利用环丝氨酸浓缩Ap~rT_c~3转化体。在648株Ap~r转化体中选出120个无性繁殖系为Ap~rT_c~3。随机挑出3株含有重组质体的无性繁殖系进行大肠杆菌素     

口蹄疫病毒主要的抗原cDNA在大肠杆菌中的无性繁殖及其表达

口蹄疫病毒(FMDV)单键基因组RNA的双键DNA拷贝在大肠杆菌质粒pBR322中无性繁殖。确立了病毒基因组的限制性图谱,并与病毒的生化图谱作了相应的排列。病毒的主要抗原,结构蛋白VP1的编码序列作了鉴定,并把该序列插入质粒载体,于λ噬菌体P_L促进子的控制下这一序列得到了表达,通过放射免疫检测方法证明了抗原多肽在一种合适寄主中的合成。     

大肠杆菌R40质体的鉴别、转化及其分子量

用Qβ噬菌体鉴别出太肠杆菌PH116为F-菌株。此菌株抗四环素,对利福平敏感。通过与菌株W1177F-Tets RifR 的接合转移试验,肯定了PH116菌株的四环素抗性基因位于R40质体上。R40质体的接合转移频率为10-7。除接合转移外,R40质体还可通过转化途径进行传递。R40 质体DNA分子呈超线团状及开放形环状。测量了103个R40质体DNA的外形长度,求得平均长度为1．03微米+0．10。R40质体DNA的分子量为2×106道尔顿左右。     

电场诱导营养缺陷型酵母原生质体的融合

本文以酿酒酵母营养缺陷型单倍体菌株; Jz-25,a,ura。和Jz-22,a,trp’ade一的原生质体为材料,采用改进的大尺寸电融合小池,以频率为1MHz,强度为450V／cm的正弦交变电场作电介质电泳,使原生质体沿电力线方向排列成串,建立起质膜间的紧密接触;接着以高强度4．5kv／cm、短时程40μs的Rc放电脉冲触发并列质膜的可逆电击穿,引起膜的通透性瞬时增大,从而导致原生质体的融合．为了进一步增大从电极间取出的融合体数目,而克服由于增高交变电场引起的使溶液过热的副作用,实验中还设计了以PEG聚集原生质体后,加高强度7．0kv／cm短时程45μs的可逆电击穿脉冲触发融合的程序。实验结果表明;上述两种电融合程序的融台频率都要比以相同材料所作的纯PEG对照实验的融合频率有所提高。通过对融合产物作交配型检验和测量细胞的尺寸,初步可以证明融合子在质融后已发生核配,产生出二倍体菌株。看来细胞电融台方法可成为一种实际应用的技术。     

体外建成带有λ噬菌体DNA片段的重组质粒

将大肠杆菌抗四环素及抗氨苄青霉素的质粒pBR322的DNA、大肠杆菌λ噬菌体DNA在体外经限制性核酸内切酶Hind Ⅲ切割,并用T4DNA连接酶连接后,以大肠杆菌K12HB101(recA~-r(?)m(?))为受体进行转化,采用插入钝化(insertional inactivation)方法选择重组质粒。利用环丝氨酸浓缩Ap~rTc~3转化体。在648株Ap~r转化体中选出120株无性繁殖系为Ap~rTc~s。随机挑出3株含有重组质粒的无性繁殖系进行大肠杆菌素El(colicin El)免疫特性测定及显微镜观察,证明为大肠杆菌素El敏感,并为典型的大肠杆菌形态。随机挑出一株含有重组质粒pAG-5的无性繁殖系,采用Zasloff等酸酚法进行重组质粒DNA提取,用Hind Ⅲ消化重组质粒DNA后进行琼脂糖凝胶电泳分析,观察到重组质粒pAG-5除pBR322质粒DNA带外含有λ-Hind Ⅲ的第5 DNA带。用重组质粒DNA再次对HB101(recA~-r(?)m(?))及K12 802(Su_(11)~+m_K~+)受体进行转化,转化体在含氨苄青霉素培养基平皿上生长,但在含四环素培养基平皿上不生长,再次证明为Ap~rTc~5.每微克重组质粒DNA Ap~r转化体为4.0—4.6×10~3。     

相同交配型酵母原生质体电融合及融合体的分析

本文报道了用电场诱导相同交配型啤酒酵母单倍体菌株原生质体融合。电场诱导的融合率比聚乙二醇(PEG)诱导的融合率高2—4倍。并对融合体进行了分析,融合体的细胞体积约为亲株细胞体积之和,DNA含量也比亲株高,有的为亲株的两倍,有的为亲株的三倍左右,融合体的生物量也比亲株高,如FD－5的生物量约为亲株的三倍,具有一定的生产应用价值。