Intein 介导的重组人AR DBD的原核可溶性表达、纯化及活性鉴定

雄激素受体通过DNA结合域与效应元件结合发挥作用,在以往的研究中多采用与GST或Protein A融合的方式对雄激素受体的DNA结合域(AR DBD)进行重组表达,但获得无融合标签的纯AR DBD的操作非常繁琐。现借助内含肽介导的自剪切作用经一步亲和层析得到纯度较高的无融合标签的AR DBD,以利于对其性质和功能的研究。通过PCR方法扩增了编码人雄激素受体520~644位氨基酸的核苷酸序列,将该序列克隆入pTWIN1融合表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)后对诱导温度及IPTG浓度进行优化,重组蛋白几乎全部可溶表达。将可溶性部分吸附到几丁质亲和层析柱上,通过pH诱导的内含肽自剪切作用释放出不含融合标签的重组人AR DBD蛋白,凝胶阻滞分析证明该蛋白只特异性结合保守的雄激素响应元件(ARE),具备正常的生物学活性。     

新型抗结核分枝杆菌药物筛选模型的建立

为建立基于酶水平和细胞水平的新型抗结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）药物的筛选模型,以M.tuberculosis H37Rv基因组DNA为模板,PCR特异性扩增异柠檬酸裂解酶（ICL）基因,构建表达载体,在E.coli BL21（DE3）中高效表达,使用N i2＋亲和层析柱纯化重组ICL,检测其活性。优化ICL酶反应条件,考察待筛选样品溶剂对酶活性的影响,建立ICL抑制剂酶水平筛选模型;考察与优化耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegma）在以乙酸盐为唯一碳源的培养基中的生长状况,建立基于M.sm egma的乙醛酸代谢途径抑制剂的细胞水平筛选模型;利用上述2种筛选模型对1 060种可能具有拮抗活性的微生物代谢样品进行初筛和复筛,两者筛选结果正相关性较好。