根癌土壤杆菌SCUEC1菌株尼古丁降解代谢中agnE基因的克隆与功能鉴定

【目的】本研究对尼古丁降解菌根癌土壤杆菌SCUEC1菌株中agnE基因进行克隆表达,并对agnE基因表达蛋白进行功能鉴定。【方法】通过PCR扩增获得agn 全长基因(1029 bp),构建重组质粒pET28a-agnE,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行异源表达,采用SDS-PAGE检测重组蛋白。以2,5-二羟基吡啶作为反应底物,在检测波长320 nm下测定反应液吸光度值,进一步研究温度、pH值和金属离子对AgnE蛋白酶活性的影响。【结果】克隆得到基因agnE,构建了p ET28a-agnE重组质粒并进行了表达,AgnE蛋白分子量为42.0 kDa,表达蛋白以包涵体形式存在于细胞中。酶促反应0、5、10、20 min时反应液吸光度分别为0.6170、0.2273、0.0907、0.0667。在pH 8.0、温度20°C下,AgnE蛋白具有较高的2,5-二羟基吡啶双加氧酶活性,且Fe2+对酶活性具有明显的促进作用。【结论】明确了Agn E蛋白具有2,5-二羟基吡啶双加氧酶活性。