琥珀蚕孵化酶基因AaHE的克隆及启动子活性分析

[目的]琥珀蚕Antheroea assama具有典型的野蚕特征,蚕卵孵化不齐,严重影响琥珀蚕的室内规模化饲养.本研究旨在探究对琥珀蚕卵孵化起关键作用的孵化酶(hatching enzyme)基因及其启动子序列特征,为进一步选择合适的抑制剂或促进剂调节琥珀蚕卵的孵化奠定基础.[方法]采用RACE技术克隆琥珀蚕孵化酶基因...     

二化性家蚕滞育、非滞育和即时浸酸卵中糖代谢相关酶mRNA水平和活性的变化

【目的】探究家蚕Bombyx mori胚胎发育早期卵内糖代谢与滞育的关系。【方法】以家蚕二化性品种"秋丰"活化越年卵为材料,一部分于17℃暗催青,孵化后常规饲养,制备非滞育命运卵(ND);另一部分于25℃明催青,孵化后常规饲养,制备滞育命运卵(DD),再用盐酸溶液处理部分DD卵制备即时浸酸卵(IA)。在卵产下或浸酸后0, 2, 6, 12, 24, 48, 72和96 h分别取样,利用qRT-PCR测定家蚕卵中己糖激酶(hexokinase, HK)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase, PFK)、山梨醇脱氢酶(sorbitol dehydrogenase, SDH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK)和海藻糖酶(trehalase, TRE)5种糖代谢相关酶基因的mRNA表达水平,利用紫外-可见分光光度法测定家蚕卵中这5种酶的活性。【结果】家蚕糖酵解途径关键酶己糖激酶(BmHK)和磷酸果糖激酶(BmPFK),以及糖分解代谢关键酶山梨醇脱氢酶(BmSDH-1)和海藻糖酶(BmTRE)在ND和IA中...     

天宫二号航天蚕后代小茧突变体sc的发现与基因定位

【目的】从2016年天宫二号空间实验室经历33 d后返回的1头成活“秋丰×白玉”杂交后代雌蚕Bombyx mori与地面“白玉”雄蚕交配的后代个体中,发现有结小茧突变体,进而分离并建立了飞天蚕(space silkworm)正常茧品系TG和小茧突变体品系sc。本研究通过对sc进行遗传分析和基因定位,旨在揭示产生小茧突变体的基因。【方法】对TG和sc进行表型分析;以sc, TG和正常大茧品系0223V1为试验材料,组配(sc♀×0223V1♂)F₁及回交群体BC₁F——(sc♀×0223V1♂)F₁♀×sc♂和BC₁M——sc♀×(sc♀×0223V1♂)F₁♂。以sc, 0223V1和F₁基因组DNA为模板,每个连锁群随机选10个SSR引物进行PCR扩增,筛选多态性SSR标记。利用雌性家蚕减数分裂染色体不交换的特点,用BC₁F确定sc基因所属连锁群;再根据家蚕SSR分子标记连锁图谱,用BC1M进行基因定位。【结果】表型分析表明sc幼虫体型小于TG幼虫的,蚕茧重约为TG的1/2。遗传分析表明突变受一对隐性基因sc控制;基因定位结果表明该基因位于家蚕基因组第3连锁群S2930-363和S2930-289 SSR标记之间,物理距离为684 kb,包含33个候选基因。【结论】飞天蚕小茧突变受位于家蚕基因组第3连锁群的一对隐性基因sc控制。     

家蚕滞育关联山梨醇脱氢酶基因的启动子活性分析

【目的】明确家蚕Bombyx mori滞育关联基因山梨醇脱氢酶基因BmSDH(BmSDH-1,BmSDH-2a和BmSDH-2b)的转录特性。【方法】用5'RACE技术确定家蚕3个BmSDH基因的转录起始位点。利用PCR技术克隆3个BmSDH基因约1 kb及BmSDH-2a不同长度的启动子区序列,分别构建带有萤火虫荧光素酶报告基因的载体pGL3-BmSDH-P-luc,并与pRL-CMV报告质粒(含海肾荧光素酶报告基因)共转染家蚕BmN细胞,通过双荧光素酶检测系统检测BmSDH基因启动子活性;分别在BmN细胞培养基中添加昆虫保幼激素、蜕皮激素和滞育激素,通过双荧光素酶检测系统检测不同浓度激素处理对BmSDH-2a基因启动子活性的影响。【结果】BmSDH-1的转录起始位点为A(-41),BmSDH-2a的转录起始位点为C(-41),BmSDH-2b的转录起始位点为A(-40)(翻译起始位点为+1)。双荧光素酶检测结果表明,BmSDH-2a启动子活性极显著高于BmSDH-1和BmSDH-2b启动子,BmSDH-2a 355 bp长度片段的启动子活性极显著高于674 bp和1 117 bp长度片段。用不同浓度滞育激素处理BmN细胞后,BmSDH-2a的1 117 bp启动子活性随着滞育激素浓度的升高有上升的趋势,当浓度高于100 ng/mL时启动子活性有所降低但仍保持在较高水平;用保幼激素进行处理后,随着激素浓度的升高启动子活性逐渐降低;蜕皮激素处理后,0.1 ng/mL激素显著增强启动子活性,当激素浓度继续升高启动子活性逐渐降低。【结论】确定了BmSDH基因的转录起始位点。BmSDH-2a启动子活性显著高于BmSDH-1和BmSDH-2b启动子,一定浓度的蜕皮激素能显著提高BmSDH-2a启动子活性。研究结果有助于阐明BmSDH基因在家蚕滞育中的功能。     

Bmo-miR-375-3p对家蚕丝素蛋白轻链基因BmFib-L表达的调控作用

【目的】探究家蚕Bombyx mori miRNAs对丝素蛋白轻链基因(fibroin light chain gene,Bm FibL)和P25蛋白基因Bm P25表达的调控作用。【方法】分别以Bm Fib-L和Bm P25 mRNA 3'UTR为靶序列,应用在线预测软件RNAhybrid从前期家蚕4和5龄幼虫后部丝腺(posterior silk gland)sRNA高通量测序获得的29个差异表达bmo-miRNAs中,筛选对Bm Fib-L和Bm P25具有调控作用的候选bmo-miRNAs;采用半定量RT-PCR方法在mRNA水平分析候选bmo-miRNAs及其靶基因Bm Fib-L和Bm P25在4和5龄幼虫期以及5龄第3天幼虫不同组织的表达水平;利用双荧光报告基因检测系统在家蚕细胞Bm N中验证候选bmo-miRNAs对Bm Fib-L和Bm P25表达的调控作用。【结果】筛选到一个在Bm Fib-L和Bm P25 mRNA 3'UTR上都有靶位点的bmo-miR-375-3p(曾称bmo-miR-375*)。在后部丝腺中bmo-miR-375-3p和其预测靶基因Bm Fib-L和Bm P25都有较高的表达水平,提示bmo-miR-375-3p具备调控Bm Fib-L和Bm P25表达的时空条件。miR-375-3p重组表达载体与融合了Bm Fib-L 3'UTR的萤火虫荧光素酶(luciferase)报告基因(luc)表达载体共转染Bm N细胞,报告基因luc的表达水平显著下降;而在miR-375-3p重组表达载体与融合了Bm P25 3'UTR的luc表达载体共转染Bm N细胞中报告基因luc的表达水平下降不显著。【结论】miR-375-3p显著下调Bm Fib-L基因的表达,而对Bm P25基因的表达无明显调控作用。     

木霉菌属ITS PCR-RFLP及抗病多样性差异分析

采用ITS PCR-RFLP方法对供试116株木霉属菌株进行多样性分析,对其中22株抗病优良菌株进行抗病多样性差异分析,用NTSYS-PC生物软件对DNA条带进行聚类分析,结果显示,HaeIII酶切共获得11个条带,可将供试菌株分为12种基因型;Hinf I共获得13个条带,可将供试菌株分为15种基因型。由116株木霉菌株的聚类图表明,木霉属菌株遗传相似系数变异范围为0.72-1.00。由22株抗病优良菌株的聚类图表明,在遗传相似系数为0.66处可将22株菌分为2类,其中ACCC 30371由于其酶切图谱的特异性在遗传相似系数为0.66处同其他菌株完全分开;在遗传相似系数为0.73处可将剩余21株菌分为2类,第一类中对9种病原菌全部表现抗性的菌株有6株,第二类中对9种病原菌全部表现抗性的菌株有2株。结果证明,本研究方法基本可将木霉属真菌归类,但所获数据在分析本属的抗病差异性这一现象上不够充分,对于其中可能存在的原因予以分析探讨。