沙蚕蛋白酶的荧光标记及细胞摄取机制研究

该文利用FITC对沙蚕蛋白酶(NAP)进行荧光标记,并通过薄层色谱法、红外光谱法、紫外光谱法及荧光光谱法对标记物进行表征,紫外分光光度法计算标记度。通过测定NAP与FITCNAP的酶促反应动力学参数来比较NAP在标记前后的活性,同时应用MTT法考察NAP标记前后对NCI-H1299细胞毒性的影响。流式细胞术研究NCI-H1299细胞摄取FITC-NAP的机制,荧光显微镜定性观察NCI-H1299细胞对FITC-NAP的摄取。结果表明,每分子标记物约含1.78分子FITC,其最佳荧光激发波长为490 nm、发射波长为515 nm;荧光标记后NAP的活性未受到显著影响; NCI-H1299细胞对FITC-NAP的摄取与药物浓度、作用时间呈正相关;氧化苯砷组的荧光强度低于FITC-NAP组且有极显著差异(P0.01),因此NAP的摄取机制为内吞。进一步研究发现, NCI-H1299细胞摄取NAP受到网格蛋白依赖性内吞和小窝/脂筏蛋白介导的内吞共同作用。荧光显微镜观察发现,随着时间的增加,更多的细胞摄入FITC-NAP,且主要分布在细胞膜及细胞质中,细胞核中未见分布。