三疣梭子蟹PtToll-1受体的原核表达及组织、细胞分布研究

为深入研究三疣梭子蟹Toll受体的功能, 在前期工作的基础上构建了PtToll-1胞外结构域原核表达载体, 并成功获得其重组蛋白。将获得的重组蛋白免疫小鼠获得抗此重组蛋白免疫抗血清用于后续研究。SDS-PAGE结果表明, 体外诱导表达重组蛋白rPtToll-1以包涵体的形式出现在大肠杆菌裂解液的沉淀中, 分子量大小约为87.18 kD; Western-Blot分析表明, 小鼠抗血清能与rPtToll-1特异性结合。利用免疫荧光及细胞免疫化学方法对三疣梭子蟹PtToll-1在消化道、肝胰腺、鳃、心脏和肌肉等组织及血淋巴细胞中的分布进行研究。此外成功构建PtToll-1完整蛋白的真核表达载体pEGFP-N2-PtToll-1, 并转染HEK293T细胞研究其在哺乳动物细胞HEK293中的表达。组织免疫荧光结果显示, PtToll-1在三疣梭子蟹消化道、肝胰腺、鳃、心脏及肌肉等组织中均有分布, 但在鳃及消化道的组织结构中表达较强; 细胞免疫荧光及免疫化学结果均表明PtToll-1主要分布在血淋巴的细胞膜上; 激光共聚焦显微技术观察发现, pEGFP-PtToll-1融合蛋白也主要在HEK-293T细胞膜上表达。研究结果将为三疣梭子蟹Toll受体蛋白的免疫学功能的研究奠定基础。     

三疣梭子蟹NF-κB家族基因Relish和Dorsal的克隆及表达特征

为研究Relish和Dorsal在三疣梭子蟹免疫过程中所起到的作用, 研究利用RACE技术克隆获得三疣梭子蟹Relish(Pt-Rel)、Dorsal基因(Pt-Dor) cDNA全长, 并通过实时荧光定量PCR技术分析了Pt-Rel和Pt-Dor基因在健康蟹不同组织及其原代培养的血淋巴细胞在感染不同微生物后的表达情况。结果显示, Pt-Rel cDNA长3254 bp, ORF长2949 bp, 编码983个氨基酸, Pt-Dor cDNA长2348 bp, ORF长1911 bp, 编码637个氨基酸; 蛋白结构预测分析发现Pt-Rel和Pt-Dor均包含RHD (Rel homology domain)及IPT (Immunoglobulin-like fold, Plexins, TranscriPtion factors)Rel/NF-κB家族蛋白经典结构域。Pt-Rel和Pt-Dor与其他节肢动物Relish、Dorsal氨基酸序列具有很高的相似性; 在系统进化分析中Pt-Rel和Pt-Dor分别与中华绒螯蟹等甲壳动物的Relish、Dorsal聚在一支, 而昆虫类聚在另一支。Pt-Rel和Pt-Dor在检测的6种组织中均有表达, 且2个基因均在血淋巴细胞中表达量最高。蟹血淋巴细胞体外感染实验结果表明, 不同病原微生物对2个基因表达的影响非常相似, 假丝酵母在2h明显诱导了Pt-Rel和Pt-Dor基因的表达, 而金黄色葡萄球菌及溶藻弧菌在感染4h后使Pt-Rel和Pt-Dor基因的表达显著上调。上述研究结果表明Pt-Rel和Pt-Dor基因很有可能参与了三疣梭子蟹的抗感染免疫过程。     

缢蛏养殖池塘氨氧化微生物的季节变化特征

为探究缢蛏(Sinonovacula constricta)养殖池塘中氨氧化细菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)的季节变化及其环境因子相关性, 试验以amoA基因为分子标记, 利用荧光定量PCR技术对养殖池塘水体及沉积物中的AOA和AOB进行了研究。结果显示, 季节变化对于水体及沉积物中的AOA和AOB的amoA基因丰度有一定的影响, 不同季节的水体及沉积物中AOA含量均比AOB含量高一个数量级。其中水体中AOB在秋季显著高于其余三季(P<0.05); AOA在冬季最低, 且显著低于春秋两季(P<0.05)。沉积物中AOB和AOA均在冬季显著高于其余三季(P<0.05)。环境因子相关性分析结果表明: 水体中AOB丰度与氨氮成显著正相关(P<0.05), 与亚硝氮成显著负相关(P<0.05); AOA丰度与水温成正显著相关(P<0.05), 与硝氮成负显著相关(P<0.05)。沉积物中AOB丰度与溶解氧、硝氮、总氮及亚硝氮成显著正相关(P<0.05), 与水温成显著负相关(P<0.05); AOA丰度与溶解氧、总氮、硝氮成显著性正相关(P<0.05), 与水温成负显著相关(P<0.05)。多元线性回归方程结果显示, 缢蛏养殖池塘的AOA及AOB丰度与硝氮密切相关。研究表明, AOA在缢蛏养殖池塘氨氧化进程中占据主导地位, AOA和AOB丰度受盐度、温度、氮素浓度及溶解氧等环境因子的共同影响。     

基于高通量测序的缢蛏及其养殖池塘菌群结构的季节变化

为探究缢蛏养殖过程中养殖环境和缢蛏体内的细菌群落结构季节变化特征及其与环境因子的相关性,采用高通量测序技术对缢蛏养殖池塘的水体、沉积物及缢蛏内脏团细菌菌群进行了研究.结果表明: 水体中冬季的细菌菌群结构与其他3季差异显著,沉积物和缢蛏内脏团4季的细菌菌群结构均无显著差异.水体各季节细菌群落的Shannon多样性指数无明显差异,沉积物及缢蛏内脏团细菌群落Shannon多样性指数夏季最低,冬季最高.门水平上,蓝细菌门、变形菌门和拟杆菌门为水体的优势菌群;变形菌门、绿弯菌门和拟杆菌门为沉积物的优势菌群;柔膜菌门和变形菌门为缢蛏内脏团的优势菌群.属水平上,水体冬季的优势菌属为NS3a_marine_group,而其余3季为聚球藻属;沉积物优势菌属为厌氧绳菌科下的一类菌属norank_f_Anaerolineacea和硝化螺旋菌属;内脏团优势菌属为支原体属和弓形菌属.环境因子与菌群的相关性分析表明: 水体的优势菌属聚球藻属与水温、化学需氧量(COD)、PO₄^--P、NH₄⁺-N、pH和透明度呈正相关;沉积物的优势菌属厌氧绳菌科菌属norank_f_Anaerolineacea与COD、水温、总磷呈正相关;缢蛏内脏团的优势菌属支原体属与水温、pH、NH₄⁺-N、PO₄^--P和透明度呈正相关.这表明不同季节的缢蛏养殖池塘及缢蛏体内细菌群落结构及多样性差异较大,水体细菌菌群受养殖环境的影响明显,尤其是水温及氮磷含量.