LDL受体基因cDNA的RT－PCR分离、克隆及其在RFLP中的应用

利用ＲＴ－ＰＣＲ技术分离低密度脂蛋白受体基因ｃＤＮＡ,将长为２６０５ｂｐ的ｃＤＮＡ插入质粒ｐＪＮ６,并经全序列测定证实,该序列与已报道序列相比,存在两个变异碱基,即第７５４位Ｃ→Ｔ,和１６５４位的Ｇ→Ａ,这两个变异碱基并不改变编码的氨基酸,利用ＬＤＬ受体基因ｃＤＮＡ中的ＣｌａⅠ片段作为探针,检测到ＬＤＬ受体基因上外显子８的ＳｔｕⅠ位点是个限制性片段长度多态性位点。所克隆的ｃＤＮＡ含有可译框架的全部密码,因此可作为基因表达材料。     

创新驱动引领下的广东省遗传学研究

<正>遗传学(genetics)是探究生物遗传和变异规律的科学。从1866年孟德尔发表"植物杂交实验"论文,标志着经典遗传学的创立;到1953年沃森和兊里兊提出DNA双螺旋结构模型,开启了分子遗传学研究的大门;随着分子生物学的发展和多学科交叉融合,以PCR技术、DNA重组技术、高通量基因组测序     

PCR-RFLP检测LDL受体基因TaqⅠ多态性位点的研究

应用聚合酶链反应(PCR)扩增人类LDL受体基因外显子4-内含子4-外显子5片段,PCR产物为1.55kb,DNA片段经序列鉴定后,进行TaqI酶切位点的RFLP分析。结果显示:中国汉族人群LDL受体基因中存在着TaqⅠ酶切位点多态性; 200个LDL受体等位基因中TaqⅠ酶切位点出现的频率为0.515,该点频率较为适中, 可作为中国汉族人群LDL受体基 因的遗传标志来进行家族性高胆固醇血症(FH)的基因诊断。所建立起的LDL受体基因TaqⅠ位点的PCR -RFLP方法具有快速、简便的特点,在FH的基因诊断上有应用价值。 Abstract:To develop rapid and sensitive technique for detectin the TaqI polymorphism at the human LDL receptor gene in Chinese,the exon4-intron4-exon5 of the human LDL receptor gene was amplified by polymerase chain reaction(PCR).The PCR products were directly analysed by restriction fragment length polymorphisms(RFLP).The results showed that the TaqI polymorphism is associated with the LDL receptor gene in Chinese of Han nationality;The frequency of T= allele (presence of TaqI cutting site)is 0.515 in 200 LDL receptor alleles.This technique may be used for rapid and sensitive screening of the LDL receptor gene for the TaqI polymorphism.     

腺病毒介导的人巨细胞病毒UL49基因小鼠模型的建立

建立表达HCMV UL49 基因的转基因小鼠,为抗病毒药物研究提供有效的实验动物模型。本实验将UL49-GFP基因插入腺病毒穿梭质粒pDC316中,构建重组质粒pDC316-UL49-GFP,与腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,3Cre 通过脂质体介导共转染293 细胞,重组产生腺病毒Ad-UL49-GFP, 经PCR和Western Blot鉴定正确后,大量扩增、纯化,制备高滴度重组腺病毒。纯化腺病毒经尾静脉注射感染小鼠,通过荧光定量PCR 和Western blot 方法,检测UL49 基因在小鼠体内组织分布和表达时相。结果显示UL49基因在小鼠的心、肝、脾、肺、肾组织均有表达,并且表达量由高到低顺序依次是：肝、脾、肾、心、肺,在腺病毒感染第3天在各靶器官表达水平较高,此后逐渐下降,第14天时仅存在肝和脾中。表明表达UL49基因的小鼠模型构建成功。小鼠模型的成功建立为下一步筛选以UL49基因为靶的抗病毒药物奠定了基础。     

正交试验优化ELISA检测中TMB/HRP显色体系的研究

目的:建立ELISA显色体系的优化方法,优化TMB/HPR显色系统的反应参数.方法:首先采用单因素试验,研究显色体系中的缓冲溶液pH、TMB浓度、H<,2>O<,2>浓度、反应时间和温度对显色的影响,在此基础上,再进行5因素4水平的正交试验.结果:TMB/HRP体系的最佳工作条件:缓冲液pH为5.0,TMB浓度为2.5mg/ml,H<,2>O<,2>浓度为O.03%(V/V),反应温度为30～50℃,反应时间为10min.结论:优化的TMB/HRP最佳反应条件,可以满足一般反应的要求,所建立的TMB/HRP体系的优化方法也适用于其它ELISA显色系统的优化.     

M1RNA及其在基因治疗上的研究进展

M1RNA是E.coli体内一种具有催化活性的RNA分子,能特异性的切割靶RNA分子,可用来抑制基因的表达,由M1RNA发展而来的M1GS是一种潜在的基因治疗药物,在病毒性疾病和肿瘤治疗上有着广阔的应用前景。     

T7启动子在哺乳类动物细胞中启动外源基因表达的研究

人低密度脂蛋白（LDL）受体基因cDNA和氯霉素已酞转移酶基因（CAT）及PolyA信号序列被克隆进pGEM4载体的T7噬茵体启动子下游,构建成质粒pT7LDLR和pT7CAT．两个重组质粒转化CHO细胞．PCR和CAT酶实验显示：两个基因被T7噬菌体启动子所启动．结果证实真核生物RNA聚合酶能够识别T7启动子,转录外源基因．常用的含有T7启动子的质粒可同时作为原核生物和真核生物的表达载体．     

改进型外部引导序列抑制人巨细胞病毒UL49 基因的表达

外部引导序列（EGS）技术（The EGS-based technology）是一种新型的基因沉默技术,能诱导内源性的核酶 P（RNase P）对靶mRNA进行有效切割. 以人类巨细胞病毒（HCMV）UL49基因mRNA片段为靶序列,基于前人实验基础上设计出更为精简与高效的改进型EGS (miniEGS),DNA片段长度仅为12 bp. 构建稳定表达HCMV UL49的细胞系,通过应用荧光定量PCR及Western 印迹分别鉴定miniEGS对内源性UL49的抑制效率.结果显示,miniEGS能在HeLa细胞中能达到很高的转染效率（97.9%）,并且在转染稳定表达UL49的HeLa细胞系后,发现UL49基因的mRNA与蛋白表达水平都出现明显下降（50%）.研究表明, 改进型的EGS序列不仅能有效抑制目的基因的表达,同时因其序列设计的精简性与高效性,可更好地应用到以后的抗病毒研究中.     

高GC含量的鳜鱼rRNA基因家族的克隆

动物rRNA基因是一种GC含量较高、结构复杂的重复序列。该研究结合亲缘生物法生物信息学技术,经反复摸索后选用LA PCR法即LA PCR Taq酶结合GC缓冲液来扩增鳜鱼复杂的rRNA基因重复序列,经测序鉴定最终克隆了鳜鱼的3个rRNA基因及其2个间隔序列。分析了鳜鱼与相关动物的rRNA基因序列的同源性和进化关系。探索了克隆复杂DNA序列时引物设计的特别规则、反应体系的改进、DNA聚合酶的选用、循环参数的调整等措施。