黄地老虎颗粒体病毒的研究IV包涵体、病毒粒子蛋白及其血清学的特性

利用反复调等电点的方法制备的AGV—XJ的包涵体A和B蛋白在沉降分析中均边一个峰的纯度。SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳显示AsGV—xJ的包涵体A蛋白有三个条带,其分子量分别为32,000、25,5 00和22,000。B蛋白和病毒粒子蛋白都由11个结构多肽组成,其分子量范围分别为100,o。0—22,500和95,0fll一12,000。我们还对AsGV—xJ的包涵体A蛋白作了氨基酸组成的分析。免疫扩散试验表明A、B蛋白和病毒粒子间均有血清学反应。     

雪莲PBP基因表达载体的构建

目的:利用新疆雪莲特殊功能基因磷脂酰乙醇胺结合蛋白基因(XLPBP)与基础质粒构建植物表达载体pXLPBP,为介导该基因在植物中表达,以期提高植物抗寒力的转基因研究打下基础。方法:利用设计好的两端加有EcoRⅠ酶切位点的引物,对XLPBP全长基因片段进行PCR扩增,获得700bp左右大小的片段,将其纯化回收并与同样经过EcoRⅠ酶切的质粒pCAMBIA3301连接;然后采用冻融法和电击法,将含XLPBP基因的载体pCAMBIA3301转入根癌农杆菌中。结果:通过一系列分子克隆方法获得含雪莲XLPBP基因的植物表达载体,并经PCR实验证实。结论:利用以自身携带的非编码区为调控序列的XLPBP全长基因和双向表达载体pCAMBIA3301为基础构建植物表达载体,可望提高外源基因表达量。     

雪莲类PEBP基因在大肠杆菌中的表达及鉴定

本实验旨在构建雪莲类PEBP基因原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化类PEBP基因所编码的蛋白,为进一步研究奠定基础.将雪莲类PEBP基因开放阅读框序列克隆到原核表达载体pET30( )上,转化感受态表达菌株BL21(DE3),低浓度IPTG低温诱导融合蛋白的表达,纯化产物,Western blotting鉴定目的蛋白.IFTG低诱导PEBP,经SDS-PAGE分析,其相对分子量约为28 kD,与预期相符,表达量约占菌体蛋白的26.8%,并且通过亲和层析纯化了重组融合蛋白,Western blotting鉴定为阳性.成功构建了原核表达载体pET-PEBP,获得了高效表达产物,并为进一步研究雪莲类PEBP基因的抗冻功能打下基础.     

一种从培养皿上挑取阳性噬菌斑的改进方法

从密集噬菌斑的培养皿上挑选少数几个阳性噬菌斑是一件繁琐而又容易出错的工作。以往的做法是在阳性噬菌斑周围多挑选几个 ,然后通过重复杂交筛选 ,直到准确筛选出阳性噬菌斑为止 ,但该方法对于大规模筛选显得非常笨拙。这里介绍一种改进方法 ,只需一次杂交筛选即可准确挑出阳性噬斑 ,做到省时、省力、省材 ,而且准确性非常高。     

黄地老虎颗粒体病毒DNA片段在枯草芽孢杆菌中的克隆

EcoRI酶解的AsGV-XJ DNA和质粒pUB 110 DNA,经T4 DNA连接酶连接后,转化枯草芽孢杆菌BR 151感受态细胞,涂布在加有新霉素(5,ug／ml)的完全培养基上。用琼脂糖凝胶电泳快速法检测抗新霉素转化子中的重组质粒。在388个转化子中得到12个较PuB110 DNA分子量大的重组质粒。所有重组质粒均可与”PdcTP标记的Fco RI酶解AsGV—XJDNA片段的探针进行分子杂交。通过琼脂糖凝胶电泳对重组质粒中插入AsGV一XJ DNA 片段进行了测定。     

杨树毒蛾核型多角体病毒在病虫脂肪体细胞中的形态发生

本文介绍杨毒蛾核型多角体病毒(Leucoma selicis Nuclear Polyhedrosis Virus)在病虫脂肪体细胞中的形态发生,描述了病毒粒子的形成和包被,包含体的沉积过程以及相伴随的细胞病变。     

正常人体淋巴细胞cDNA文库的构建

应用GIBCOBRL建库试剂盒建立了正常人体淋巴细胞cDNA文库。取新鲜的正常人外周血,分离出淋巴细胞,进行体外培养,提取总RNA,纯化mRNA,并将其反转录成cDNA,与SalI和NotI接头连接后插入λZipLox载体,体外包装后转染到Y1090宿主菌中,进行滴度测试及文库扩增。构建的正常人淋巴细胞cDNA文库含2-6×106重组子,克隆效率为5×1012重组子/g cDNA,插入片段长度约为1~5kb。扩增后的文库浓度为3×107重组子/μl,将文库稀释到10-6时所产生的噬菌斑密度最为适宜。试验结果表明,该库符合标准,所构建的正常人淋巴细胞cDNA文库为进一步筛选目的基因、制作基因芯片等提供了有效的工具。 Abstract:A lymphocyte cDNA library of normal human was constructed in order to obtain specific gene and prepare lymphocyte gene chips to detect the relative genes between psychiatric diseases and immunity.The lymphocyte was abstracted from fresh normal human blood and cultured in vitro.Total RNA of lymphocyte was extracted from the cultured cells and then mRNA was extracted further.Moreover,single-strand cDNA and double-strand cDNA were synthesized in turn.The double-strand cDNAs were ligated to SalI and NotI adaptor,which were later ligated to arms of λZipLox.Ligated-cDNAs were packed in vitro,and then infected E.coli Y1090.Titering the phage and amplifying the library.The lymphocyte cDNA library consisted of 2-6×106 recombinants with the length of 1~5kb and the cloning efficiency was 5×1012 recombinants/g cDNA.The amplified library was 3×107recombinants/μl in concentration and the number of bacteriophage plagues was the most suitable in density after it was diluted to 10-6 in concentration.The constructed cDNA library of normal human lymphocyte would be helpful to further detecting target genes and preparing gene chips etc.     

应用差减杂交筛选雪莲低温特异表达基因

目的:获得雪莲低温特异表达基因cDNA全长片段。方法:以低温诱导雪莲为目的材料,常温诱导为对照,采用抑制差减杂交(SSH)方法,构建了雪莲的差减cDNA文库,筛选文库并得到38个cDNA片段。结果:利用GenBank数据库Blastx进行同源性搜索发现有22个非冗余克隆,其中18个已知基因4个未知基因。结论:同源分析表明冷诱导基因和磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)也在其中。所取得的结果为日后进一步对新疆雪莲抗寒机理的研究和更好地分离低温特异表达基因奠定了基础。     

筛选转抗寒基因棉花的简便方法

该研究直接利用自然低温条件,在试验田对转抗寒基因的棉花植株的抗寒表现进行分级鉴定和筛选,再将抗寒能力强的植株进行标记基因表达和分子生物学检测,获得转抗寒基因的棉花植株。这种方法具有工作量小、实验群体小、费用低、结果准确可靠等优点。