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RNA-seq技术能够全面快速地获得物种在某一状态下的转录本序列信息,但测序并组装后的大量Unigene往往不包含完整ORF(Open reading frame)。转录组库具有一定的冗余性,存在着属于同一个转录本的Unigene,这些Unigene因为无重叠区不能拼接而存在转录组库中。基于这种情况,为了拼接铵转运蛋白家族Unigene,首先挑选注释为AMT(Ammonium transporter)且ORF不完整的所有Unigene(5条),通过分析Unigene在4个转录组的表达模式,其中2条Unigene(Uni4和Uni5)具有相同的表达模式,推测可能来自同一转录本。然后通过NCBI blastx将这2条Unigene与参考物种的AMT蛋白质比对,确定其在转录本的位置及序列相互间没有交叠(如果两条编码序列相互交叠则不能组成同一个转录本)。结果发现Uni4和Uni5分别位于参考转录本5′端和3′端位置,因此假定它们属于同一个转录本,中间空缺约120 bp未知序列。通过试验验证,分别在Uni4和Uni5上设计单正向引物和单反向引物,PCR扩增得到约800 bp片段,将其测序并与两条Unigene比对,证实Uni4和Uni5属于同一转录本且获得了缺失的未知序列。最终拼接得到1 667 bp序列,包含1 482 bp完整ORF,编码494个氨基酸,通过系统进化分析将其归类为amt1亚家族,命名为Seamt1。生物信息学手段预测Se AMT1蛋白与已知的其他物种AMT性质相似。本研究采用转录组Unigene表达模式聚类的方法挖掘潜在的同一转录本Unigene,并且通过另外两组Unigene检验了该方法的可行性。这一便捷方法有助于转录组中Unigene的延伸和拼接,有助于完整ORF的获得及后期基因功能研究。 相似文献
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Na+/H+逆向转运蛋白具有调节细胞内离子浓度及维持pH值稳定的作用,是植物抵御盐胁迫的重要因子。从盐角草RNA-Seq数据中筛选Na+/H+逆向转运蛋白序列,利用生物信息学手段,拼接得到5条Na+/H+逆向转运蛋白完整cDNA序列,通过与NCBI已有序列比对分析,将其命名为SeNHX1、SeNHX3、SeNHX4、SeNHX5和SeN-haD。考察盐角草Na+/H+逆向转运蛋白在两种盐分变化情况下的表达变化:1)从无盐处理转移到200 mM NaCl处理;2)从200 mM NaCl培养基转移到无盐培养基。结果表明:SeNHX4的表达量非常低,在地下部几乎检测不到;SeNhaD在地上部的表达量是地下部的2倍左右,说明NhaD主要在盐角草地上部发挥作用;SeNHX1、SeNHX3和SeNHX5的表达量明显高于其他两个基因,对盐角草的耐盐机制起到更大的作用,并且SeNHX1和SeNHX5受盐分诱导表达,表达量与盐浓度呈正相关,可能在盐角草耐盐调控网络中发挥重要作用。综上,NHX基因家族和NhaD的表达量受到基质中盐分的调控作用,其表达在盐分处理或者盐分去除1~3d后发生变化。研究结果有助于阐明盐角草NHX基因家族和NhaD对盐分的响应特点。 相似文献
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