重组人神经生长因子rh-β-NGF真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

为大量制备β-NGF,构建了一种稳定、高效表达重组人神经生长因子(Recombinant human nerve growth factor,rh-β-NGF)的真核表达载体及含该重组载体的HEK293细胞株。首先,构建重组质粒p CMV-β-NGF-IRES-dhfr并转染至HEK293细胞系,用MTX加压筛选和有限稀释法进行选择,获得高效表达rh-β-NGF的单克隆重组细胞株;随后逐步降低血清培养,最终使细胞株完全适应无血清培养基并稳定表达rh-β-NGF;SDS-PAGE分析该表达产物,可见相对分子质量约13 k Da的条带,纯度大于50%,经质谱法测定得到其肽图谱与理论序列完全匹配,接着利用离子交换层析和分子筛层析纯化rh-β-NGF;最后进行重组细胞株表达效率和表达稳定性检测,表明重组细胞株可稳定、高效表达rh-β-NGF,其分泌效率大于20 pg/(cell?d),并能诱导PC12细胞的分化,具有良好的生物学活性。     

大熊猫国家公园四川片区自然保护地空间关系对大熊猫分布的影响

理清自然保护地的空间关系与分布格局是加强空间管控、整合优化自然保护地体系的基础。以大熊猫国家公园四川片区内的自然保护地为案例,基于ArcGIS空间数据的处理、分析与可视化表达等功能,结合韦恩(Venn)图在空间层面上量化分析了公园范围内各类自然保护地的空间关系,并进一步揭示了不同保护情景下大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)的分布格局。研究结果表明:(1)研究区内含有6类自然保护地,占研究区总面积的75.13%,其中40.68%为交叉重叠区域。(2)各类自然保护地皆存在大面积的交叉重叠。自然保护区为研究区面积最大的自然保护地类型,占自然保护地总面积的72.53%,其中45.89%为交叉重叠区域;其他类自然保护地占自然保护地总面积的60.87%,其中66.48%为交叉重叠区域。(3)猫点密度与自然保护地的交叉重叠程度呈现逆向增长趋势,区域的重叠水平越高,猫点密度越低。(4)自然保护地整体非重叠区的猫点密度高于重叠区。自然保护区是整体猫点密度最高的自然保护地类型,其非重叠区密度明显高于重叠区;森林公园非重叠区与水利风景区重叠区呈现较高的猫点密度。(5)与自然保护区交叉重叠...     

美国医生信息公开的指标遴选及内容研究

医生质量信息公开具有改善患者选择,促进医生质量提升以及缓解医患纠纷的重要意义。其中质量指标遴选及测量的科学性直接影响公开的社会认同度和效果。以美国医疗保险和救助中心的医生比较网站为例,介绍了医生信息公开的内容,包含患者安全、糖尿病、心脏病及预防保健多个维度指标及公开指标的遴选过程;重点探讨借鉴其多元及规范的公开内容、通过多种渠道与利益集团合作制定最佳公开质量指标,公开前测试指标的稳定性和科学性,开发疾病模块级综合指标等科学的指标遴选举措,为我国公开医生质量信息提供循证依据。     

脂肪储存小滴蛋白5 重组腺病毒的制备

目的:利用AdEasy腺病毒表达系统构建含有小鼠脂肪储存小滴蛋白5(LSDP5)基因的重组腺病毒。方法:从小鼠肝脏cDNA克隆出LSDP5基因全长,克隆至pMD18-T载体中,酶切测序。回收酶切产物,连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,构建pShuttle-CMV-LSDP5重组质粒,经PmeI酶切线性化后转化至含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中。筛选阳性克隆,提取重组质粒,PacI酶切线性化并转染AD293细胞进行包装,提取病毒DNA,鉴定重组病毒并检测病毒滴度。结果:LSDP5基因克隆经测序证实与Genebank公布一致,双酶切重组pMD18-T载体得到1400 bp左右的片段。重组穿梭载体经Kpn I和Sal I双酶切后得到预期片段。PacI酶切得到30 Kb大片段和4.5 Kb小片段。转染AD293细胞后收集病毒,经PCR鉴定,获得理想的目的片段。取病毒上清反复感染AD293细胞以扩增病毒,最后所得病毒滴度为2.5×109pfu/ml。结论:成功构建了携带脂肪储存小滴蛋白5基因的重组腺病毒载体,为进一步研究LSDP5基因功能奠定基础。     

不同剂量阿托伐他汀钙短期应用对冠状动脉粥样硬化性心脏病患者血清 胆红素水平的影响

目的:探讨不同剂量阿托伐他汀钙短期应用对冠状动脉粥样硬化性心脏病患者血清胆红素水平的影响。方法:按照详细的纳入及排除标准的筛选共计264例冠状动脉粥样硬化性心脏病患者入选,分为20 mg和40 mg治疗剂量组,观察患者用药前后胆红素水平的变化水平的改变。结果:与服药前的相比,服用阿托伐他汀钙40 mg和20 mg的患者血清总胆红素、直接胆红素水平均呈显著性上升(P0.05),而间接胆红素水平差异无显著性。服药1个月后,40 mg组患者血清总胆红素、直接胆红素水平升高较20 mg组更显著(P0.05),但两组间接胆红素水平差异没有显著性。总胆红素变化率与患者胆固醇水平呈显著相关性,其20mg组为0.419,40 mg组为0.634(P0.001)。结论:阿托伐他汀钙治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病患者可导致其血清总胆红素和直接胆红素水平升高,且高剂量较低剂量对总胆红素和直接胆红素的影响更明显。     

主体功能区视角下的生态补偿研究——以湖北省为例

合理界定区域生态补偿主客体,确定生态补偿优先级是构建区域生态补偿机制的核心内容。从主体功能区视角出发,在测算湖北省生态系统服务价值的基础上,界定生态受偿与补偿支付主体,确定生态受偿与补偿支付等级与次序。结果表明：（1）湖北省生态系统服务总价值、市场价值和非市场价值在空间分布上具有相似性,总体呈现出"西部高,东中低"的格局,高值区多集中于重点生态功能区和农产品主产区,低值区多集中于重点开发区;（2）30个重点生态功能区的生态受偿等级总体分为五级,呈现出"西高东低"的空间分布格局,房县为第一生态受偿区;（3）29个农产品主产区生态受偿优先级总体分为五级,随县为生态受偿一级区域;（4）30个重点开发区的补偿支付等级总体分为五级,呈现出"东先西后"的空间分布格局,在生态补偿支付实践中,国家层面重点开发区应先于省级层面重点开发区。     

生物炭对猪粪堆肥过程中细菌群落结构的影响

【背景】细菌群落多样性影响堆肥过程,生物炭影响细菌的生长,但生物炭对猪粪堆肥细菌群落结构的影响尚未见报道。【目的】根据细菌群落结构和堆肥温度的变化规律,添加适量的生物炭到猪粪堆肥,以提高堆肥主要细菌的占比和堆肥效率,为推广生物炭和猪粪堆肥的联合应用提供参考。【方法】设计0%、3%、6%和9%的生物炭添加量,在堆肥的高温期和温度稳定期分别取样,总共8个样品。根据IlluminaMiSeq对细菌16SrRNA基因的高通量测序结果,分析生物炭添加量和堆肥温度对猪粪堆肥细菌群落结构的影响。【结果】在细菌门水平上,猪粪堆肥主要的细菌有Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Chloroflexi、Gemmatimonadetes、Firmicutes、Acidobacteria和Deinococcus-Thermus;在细菌属水平上,猪粪堆肥主要的细菌有Chryseolinea、Subgroup_6_norank、Steroidobacter、Anaerolineaceae、Nonomuraea、Longispora、Bacillus、Sporacetigenium、Luteimonas、Phyllobacteriaceae、Truepera、Rhodothermacea和Aquamicrobium。生物炭添加量对猪粪堆肥主要细菌的生长既有促进作用,也有抑制作用。随着生物炭添加量的增加,Bacillus、Streptomyces、Rhodothermaceae和Firmicutes的丰度随之增加,而Chryseolinea、Longispora和Steroidobacter的丰度却随之减少。Firmicutes、Bacillus和Streptomyces的丰度在堆肥高温期要大于堆肥温度稳定期,而Chloroflexi、Anaerolineaceae和Longispora则相反。猪粪堆肥高温期的细菌多样性要明显大于堆肥温度稳定期。堆肥高温期的细菌群落达到70个,远多于堆肥温度稳定期的15个;其中对猪粪堆肥起主要作用的细菌,堆肥高温期时达到7个(Rhizobiales、Incertae_Sedis、Proteobacteria、Alphaproteobacteria、Xanthomonadales、Gammaproteobacteria和Steroidobacter),而堆肥温度稳定期只有3个(Micromonosporales、Longispora和Micromonosporaceae)。猪粪堆肥添加生物碳后,环境因子(电导率、含水量、温度和pH)对堆肥主要的细菌不能产生显著的影响。β-Proteobacteria、Rhodothermaceae、Phyllobacteriaceae和Bacterium是含水量、温度和pH影响最大的细菌。【结论】生物碳添加量和堆肥温度能改变猪粪堆肥的细菌群落结构,在猪粪堆肥高温期能显著增加细菌的数量和多样性。猪粪堆肥的电导率、含水率、温度和pH能影响堆肥细菌的生长,但对堆肥主要细菌的影响不显著。     

人肝癌靶向性CD80基因表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建人肝癌靶向性CD80基因重组腺病毒载体。方法:首先,从人基因组DNA中克隆AFP增强子、启动子,利用腺病毒穿梭质粒pShuttle和pShutte-CMV,采用AFP增强子替换CMV启动子,构建含有AFP启动子和增强子的穿梭质粒,命名为pShuttle-AFP。将人CD80基因克隆到pShuttle-AFP的AFP增强子和启动子之后,构建pShuttle-AFP-CD80质粒。再将其与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化E.coliBJ5183,利用同源重组构建腺病毒质粒pAd-AFP-CD80。以获得的重组子转染AD293细胞后制备重组腺病毒,并对重组的病毒进行鉴定和病毒滴度测定。结果:测序结果与Genebank中公布的AFP启动子、核心增强子和CD80基因序列相符。双酶切结果与预期结果相符。PacI酶切结果与目的结果一致。穿梭质粒pShutte-AFP-CD80和腺病毒质粒pAd-AFP-CD80经酶切和PCR鉴定均获得期望大小的目的片段。结论:成功的构建了人肝癌靶向性pAd-AFP-CD80腺病毒载体,为CD80基因在肝癌靶向性治疗的研究奠定了基础。     

脂肪储存小滴蛋白5重组腺病毒的制备

目的：利用AdEasy腺病毒表达系统构建含有小鼠脂肪储存小滴蛋白5（LSDP5）基因的重组腺病毒。方法：从小鼠肝脏cDNA克隆出LSDP5基因全长,克隆至pMD18-T载体中,酶切测序。回收酶切产物,连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,构建pShuttle-CMV-LSDP5重组质粒,经PmeI酶切线性化后转化至含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中。筛选阳性克隆,提取重组质粒,PacI酶切线性化并转染AD293细胞进行包装,提取病毒DNA,鉴定重组病毒并检测病毒滴度。结果：LSDP5基因克隆经测序证实与Genebank公布一致,双酶切重组pMD18-T载体得到1400 bp左右的片段。重组穿梭载体经Kpn I和Sal I双酶切后得到预期片段。PacI酶切得到30 Kb大片段和4.5 Kb小片段。转染AD293细胞后收集病毒,经PCR鉴定,获得理想的目的片段。取病毒上清反复感染AD293细胞以扩增病毒,最后所得病毒滴度为2.5×109pfu/ml。结论：成功构建了携带脂肪储存小滴蛋白5基因的重组腺病毒载体,为进一步研究LSDP5基因功能奠定基础。     

脂多糖通过自噬作用促进氧化低密度脂蛋白诱导的泡沫细胞的形成

目的:研究脂多糖(LPS)促进氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的泡沫细胞形成的机制。方法:人源性THP-1细胞的培养,经ox-LDL诱导形成泡沫细胞。采用油红O染色鉴定泡沫细胞的形成,免疫荧光和Western blot方法检测自噬活性,观察自噬作用对泡沫细胞脂质沉积的影响。结果:①经形态学观察,脂多糖可以促进ox-LDL诱导的泡沫细胞的形成。②脂多糖可以激活自噬作用,并且自噬活性在16h达到最强。③脂多糖可以增强自噬激活剂雷帕霉素(Rap)的促自噬作用(P0.05),并且削弱自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)的作用。④Rap单独作用不能影响泡沫细胞中脂质的累积,然而脂多糖能够增强Rap的作用,显著促进脂滴在泡沫细胞中的累积(P0.05);3-MA可以抑制基础水平和脂多糖诱导后泡沫细胞中脂滴的积累。结论:脂多糖通过增强自噬作用促进泡沫细胞的形成。