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目的 对重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析方法亲水相互作用液相色谱法进行方法学验证,并根据多批次产品的检测结果制定质量标准。方法 参考《中华人民共和国药典》2020版(三部)通则9101中相关要求及重组人源化抗CD52单克隆抗体的制造与检定规程,对单克隆抗体N-糖糖型的分析方法进行方法学验证,验证项目包括专属性、线性、准确度、精密度、范围和耐用性。对多批次重组人源化抗CD52单克隆抗体产品(≥15批)的N-糖糖型的检测结果进行分析,计算非岩藻糖及半乳糖的相对含量,确定质量标准。结果 空白对照、阴性对照对重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析无干扰;在60~300μg的抗体含量范围内线性良好,r2≥0.99;高、中、低3种抗体含量的回收率均在96%~106%;仪器进样重复性、样品制备重复性及中间精密度均良好,峰面积百分比及保留时间的RSD均≤5%;耐用性考察时各条件下的峰面积百分比及保留时间的RSD均≤5%。对多批次重组人源化抗CD52单克隆抗体的检定结果进行统计分析,确定N-糖糖型分析的质量标准为非岩藻糖相对含量4%~20%,半乳糖相对含量≥2... 相似文献
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评估淋巴瘤细胞MC/CAR、HUT78和RAMOS的CD52抗原呈现稳定性,并比较三种细胞用于抗CD52单抗活性检测中的优劣性。采用免疫荧光法检测淋巴瘤细胞MC/CAR、HUT78和RAMOS的CD52抗原呈现率,分析MC/CAR、HUT78和RAMOS传代培养5~20代CD52抗原呈现稳定性。分别以MC/CAR、HUT78和RAMOS作为抗CD52单抗结合活性和补体依赖细胞毒性的靶细胞进行检测,并比较其优劣性。结果显示,MC/CAR、RAMOS和HUT78的CD52抗原呈现率分别为95.5%、63.2%和38.3%。MC/CAR传代培养5~20代CD52抗原呈现率均大于90%。RAMOS传代培养5~13代CD52抗原呈现率介于60%~67%,第14~15代CD52抗原呈现率介于50%~60%,第16~20代细胞CD52抗原呈现率介于40%~50%。HUT78传代培养5~20代CD52抗原呈现率介于26.7%~38.9%。淋巴瘤细胞MC/CAR在抗CD52单抗的结合活性检测中呈现出更好的剂量依赖曲线。淋巴瘤细胞RAMOS在抗CD52单抗的补体依赖细胞毒性检测中呈现出更好的剂量效应曲线。CD52抗原呈现率方面MC/CAR>RAMOS>HUT78。结果表明,MC/CAR更适用于抗CD52单抗的结合活性的检测,RAMOS适用于抗CD52单抗的补体依赖细胞毒性检测。 相似文献
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草鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ基因在大肠杆菌中的表达 总被引:5,自引:0,他引:5
为构建草鱼 (Ctenopharyngodonidellus )胰岛素样生长因子 Ⅰ (IGF Ⅰ )大肠杆菌表达质粒 ,对已克隆到的草鱼IGF Ⅰ基因进行改造 .改造后的基因去除了原cDNA的信号肽和E区序列 ,并在基因的两端分别加入起始密码子和终止密码子 .将改造后的编码草鱼IGF Ⅰ成熟肽基因亚克隆到pBV 2 2 0中 ,构建成表达质粒pBVgIGF7.转化大肠杆菌 (Escherichiacoli)进行表达 .SDS PAGE显示 ,含重组表达质粒的菌株经热诱导后表达出一约 7 5kD的特异蛋白 .表达量占菌体总蛋白的2 0 0 3% ,表达产物主要以包涵体形式存在 .重组蛋白经纯化和复性后 ,采用MTT法测定其对草鱼吻端成纤维细胞PSF和草鱼卵巢细胞CO的促增殖作用 .结果表明 ,所获得的重组草鱼IGF Ⅰ具有生物活性 相似文献
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根据鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)丰要衣壳蚩白(Major Capsid protein,MCP)基因(mcp)序列设计引物,PCR扩增得到一长约1400bp的DNA片段,将其克隆到pGEM-T Easy Vector。氨基酸亲水性分析表明,在150—250位氨基酸之间亲水性很高,可构成主要抗原决定簇及形成跨膜区。mcp基因经PCR改造后克隆至原核表达裁体pBV220,构建表达MCP的大肠杆菌基因工程菌,该工程菌经42℃诱导,SDS—PAGE检测,在约50kDa处有一特异蛋白带,含量约为菌体总蛋白的23%。用纯化和复性后的蛋白免疫新西兰大白兔制备抗血清,Western—blotting分忻显示,重组MCP制备的抗血清能与ISKNV MCP特异结合,说明表达产物具有与ISKNV MCP相似的抗原特性。 相似文献
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罗非鱼绿色气球菌的鉴定及致病性研究 总被引:1,自引:0,他引:1
研究首次报道了从广东茂名市茂南区患病罗非鱼体内分离的两特殊细菌菌株Mnlv1 和Mnlv2, 通过细菌形态学、培养条件比较、生理生化特征及16S rRNA 基因检测等鉴定了该病原, 采用三种不同的感染方式对罗非鱼实施人工感染以期探讨该菌对罗非鱼的致病强度及致病条件, 同时也比较了两菌株对29 种不同的抗生素的敏感性差异。结果表明: 两菌株均为绿色气球菌(Aerococcus viridans), 革兰氏染色阳性(G+), 溶血性。感染实验结果显示, 该菌株对罗非鱼具有较强的致病性, 并且随着环境胁迫作用的加强, 鱼体发病死亡率增高。药敏试验结果显示, 两菌株为对头孢曲松、米诺四环素、诺氟沙星等15 种药物高度敏感, 对麦迪霉素、壮观霉素和新霉素3 种药物中度敏感, 对红霉素、乙酰螺旋霉素、苯唑青霉素等10 种药物不敏感。研究将为罗非鱼绿色气球菌病原的诊断及防治提供理论基础。
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两种沼虾溶菌酶基因ORF的克隆和罗氏沼虾溶菌酶基因的组织表达(英文) 总被引:8,自引:0,他引:8
分别提取罗氏沼虾和日本沼虾血细胞总RNA,RT-PCR扩增获得特异性cDNA片段,纯化后克隆到T载体上。序列测定表明所克隆的两种沼虾溶菌酶基因的开放阅读框(ORF)为477bp,共编码158个氨基酸,包括溶菌酶成熟肽140个氨基酸残基和信号肽18个氨基酸残基。同源性分析表明,罗氏沼虾和日本沼虾溶菌酶基因的碱基序列及推测氨基酸序列高度同源,分别为99.4%和98.1%。两种沼虾溶菌酶基因的碱基序列和推测氨基酸序列与Gen-Bank上其他对虾溶菌酶的同源性达83.0%和80.0%以上。两种沼虾溶菌酶都具有c-型溶菌酶典型的两个酶活性位点(Glu51)和(Asp68),以及8个保守结构氨基酸残基Cys,且在101、106和107位上缺少Asp,因而推测本实验所克隆的两种沼虾溶菌酶基因属c-型溶菌酶基因的非钙结合亚型。以PCR法制备罗氏沼虾溶菌酶基因的生物素标记探针,斑点杂交检测感染弧菌后溶菌酶基因mRNA在各组织中的转录水平,结果表明受感染6h后在眼、肌肉、鳃、肝胰腺、肠管中的表达量均有升高,其中在肝胰腺中的表达量最高,约为对照组的560%。在不同感染时间里,肝胰腺中该基因表达量有较大的变化:感染后3h表达量最低,24h后表达量升至最高,大约为对照组的430%,48h时的表达量又有所下降,但仍明显高于对照组(约为330%)。受弧菌感染后罗氏沼虾溶菌酶基因转录的上调证明溶菌酶基因在非特异性免疫中的直接作用,同时表明肝胰腺可能在沼虾的免疫防御过程起重要作用。
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鳜鱼Mx蛋白全长cDNA的克隆和序列分析 总被引:1,自引:0,他引:1
Mx蛋白是一类由I型干扰素诱导表达的抗病毒蛋白.本研究以感染了鳜传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)的鳜鱼为材料,提取肝脏总RNA,通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Mx蛋白基因的核心片段序列,再应用3'和5'快速扩增cDNA末端(RACE)方法PCR扩增Mx蛋白cDNA末端,最终获得鳜鱼Mx蛋白cDNA序列(GenBank登陆号AY392097).序列分析表明鳜鱼Mx蛋白cDNA含有2391bp,其中编码区长1881bp,编码627个氨基酸残基,推测蛋白质分子量大小为7.15kDa.鳜鱼Mx蛋白具有脊椎动物Mx蛋白共有的结构特征一个三联体GTP结合区域(GXXXSGKS/T、DXXG、T/NKXD);一个发动蛋白家族的典型结构特征序列(LPRGS/KGIVTR);以及C端高度保守的Leu拉链结构域.鳜鱼Mx蛋白全基因的获得为下一步研究鱼类Mx蛋白的抗病毒活性、作用机制,以及干扰素的检测奠定了基础. 相似文献
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斗鱼属鱼类亲缘关系的Cyt b基因序列和RAPD分析 总被引:1,自引:0,他引:1
采用mtDNA Cyt b基因序列分析和RAPD两种分子标记技术,研究了中国分布的叉尾斗鱼(Macropodus opercularis)、圆尾斗鱼(M.chinensis)和香港斗鱼(M.hongkongensis)以及越南的红鳍斗鱼(M.erythropterus)4种鱼类之间的亲缘关系.获得4种斗鱼14条Cyt b基因全序列(1 155 bp),结合GenBank中搜索到的近缘物种同源序列进行分析.从133条随机引物中筛选到36条引物,在优化的反应条件下,10个群体96个个体共扩增出清晰稳定的条带749条,构建矩阵进行分析和聚类.基于Cyt b全序列以邻接法和最小进化法构建的系统树及RAPD数据UPGMA聚类分析的结果都显示,香港斗鱼和红鳍斗鱼先聚为一分支,再与叉尾斗鱼聚类,圆尾斗鱼处于外缘.本研究结果反映了圆尾斗鱼与其他斗鱼的亲缘关系较远,种间遗传距离为0.184 5~0.225 3(Cyt b)和0.653 6~0.746 5(RAPD),两者为同一单系群中两个独立演化的自然类群;香港斗鱼与叉尾斗鱼间遗传分化明显,Cyt b碱基差异为11.00%,RAFD遗传距离达0.577 7,支持其为独立物种的观点,且香港斗鱼群体间遗传差异较大,Cyt b碱基差异为3.12%,RAPD遗传距离0.060 1;叉尾斗鱼群体间Nei's基因多样度和Shannon信息指数分别为0.058 2和0.086 9,而各群体内的数值分别为0.016 1~0.031 7和0.023 5~0.046 7,表明遗传差异主要来自群体间,并按分布流域分别聚类. 相似文献
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利用微卫星多重PCR技术鉴定剑尾鱼RR-B系 总被引:1,自引:0,他引:1
目的建立多重PCR技术鉴定选育剑尾鱼RR-B系的方法。方法根据可明显鉴定剑尾鱼RR-B系的6对特异性微卫星引物Msa012、Msa014、Msa033、Msb025、Msd003、Msd051,采用不同的组合方式对RR-B系剑尾鱼和红眼红体的非选育剑尾鱼进行多重PCR扩增。结果引物组合1(Msa014、Msb025、Msd003)和组合2(Msa012、Msa033、Msd051)两个三重PCR反应体系能清楚的扩增各个微卫星座位,且各目的片段之间无干扰,易于识别,引物组合1的排除概率为99.98%,引物组合2的排除概率为99.96%,能准确鉴定剑尾鱼RR-B系。结论本检测方法具有较高的稳定性,可快速准确鉴定剑尾鱼RR-B系。 相似文献