人粪便宏基因组α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质及其对芦丁的生物转化

HFM-rha78是本实验室从健康人体粪便宏基因组DNA中获得的新型细菌源α-L-鼠李糖苷酶基因。该基因全长2 166 bp，编码蛋白质分子质量为83 kD，等电点5.58，其二级结构以α螺旋和无规卷曲为主，整体表现出亲水性，其氨基酸序列与GenBank收录的序列一致性仅为48%。系统进化树表明，该酶被分类至亚家族Ⅱ，其催化广义酸和广义碱均为谷氨酸，催化残基高度保守。为明确其酶学性质，以对硝基苯酚-α-L-吡喃鼠李糖苷（p-nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside，pNPR）为底物，通过紫外 可见分光光度法测定产物对硝基苯酚的生成量，得到HFM-Rha78的最适反应温度为50℃，最适pH为6.5，且在30～46℃下保温30 min，不影响活力。为初步研究其对芦丁的水解能力，首先对HFM-Rha78的有机溶剂耐受性进行了研究。结果表明，该酶能普遍耐受1%的有机溶剂，甚至1%～ 5%的异丙醇和1%的β 巯基乙醇，有提高其活性的能力。当DMSO浓度为10%时，仍能保持79%的酶活性。HFM Rha78对底物pNPR的Vmax为129.9 μmol min-1 mg-1，HFM-Rha78的KM较大，为26.0 mmol L-1。转换数kcat为185.1 s-1，催化效率kcat/KM为7.1×103 s-1 mol-1 L。采用高效液相色谱仪检测HFM-Rha78水解芦丁的能力。结果表明，37℃条件下，随着酶浓度和水解时间增加，芦丁转化率增大。反应10 h时，芦丁转化率达41.8%。本研究获得了HFM-Rha78的最适反应条件，并确定其可特异性生物转化芦丁为异槲皮素。