蛋白激酶CK2与PrP蛋白的体外相互作用研究

为了探讨蛋白激酶CK2与PrP是否存在分子间相互作用,利用RT-PCR方法从人源细胞系SH-SY5Y cDNA中分别扩增出蛋白激酶CK2a和CK2β基因,并在E coli中表达了融合蛋白HIS-CK2α和GST-HISCK2β.利用pU-doWn及免疫共沉淀实验检测PrP与CK2的分子间相互作用.结果显示,重组PrP可与CK2α出现特异性结合,但不与CK2β发生反应.天然状态下脑组织中的CK2与PrPc也发生相互作用.PrP与CK2α亚基相互作用的区域位于PrP的C-端90～231位氨基酸.本研究从分子水平上提供了人重组和天然CK2和PrP蛋白相互作用的实验依据,为深入探讨CK2与朊蛋白作用的生物学意义和在朊病毒病发病过程中的作用提供了科学线索.     

一种基于链霉素沉淀的PrPSc检测方法的建立

建立一种新的基于链霉素沉淀的PrPSc的Western blot检测方法,用终浓度为60 mmol/L的链霉素处理蛋白酶K消化的PrPSc贮存液,通过离心沉淀PrPSc,用Western blot对PrPSc的链霉素富集效果进行检测.结果显示,链霉索能够与PrPSc结合形成高分子量复合物,但不影响糖基化形式.此外,基于链霉素沉淀的Western blot,无论是在低浓度或是大容积的条件下,均可显著地提高对PrPSc检测的敏感性.基于链霉素沉淀的Western blot试验是一种敏感、特异、快速及灵活的检测方法,有潜力用于脑组织、外周组织及体液中低水平的PrPSc的检测.     

重组人Doppel蛋白的表达及其细胞毒性作用的研究

Doppel(Dpl)蛋白是新近发现的PrP相关蛋白.根据GenBank公布的人PRND cDNA序列设计合成特异性引物,用PCR方法从人外周血白细胞总DNA中扩增获得531 bp的人PRND完整基因序列,测序正确后克隆至表达载体,转化大肠杆菌JM109,IPTG诱导表达重组人Doppel(rhDpl)蛋白.目的蛋白以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的60%以上.表达产物用Ni2 亲和层析柱纯化及羟胺化学裂解法去除标签蛋白,SDS-PAGE检测证实,纯化的rhDpl蛋白相对分子量约为15 kD.Trypan Blue及MTT实验显示,在50μg/mL及以上剂量时,rhDpl蛋白具有抑制人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞生长的作用,在100μg/mL及以上剂量时,rhDpl具有杀伤HeLa细胞的活性,呈现明显的剂量和时间依赖性.Hoechst33342荧光染色观察显示经rhDpl作用的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y呈现出细胞凋亡现象.这些结果提示Dpl蛋白具有体外细胞毒作用,并呈现明显的组织类型特异性.以上工作为进一步了解人Dpl蛋白体内外生物学作用奠定了基础.     

PrP及其缺失突变体与微管蛋白的体外相互作用的初步研究

为了进一步确定PrP蛋白与微管蛋白是否发生分子间相互作用以及PrP蛋白多肽链中与微管蛋白相互作用的区域,我们表达纯化了全长的PrP以及PrP蛋白缺失突变体,提取了兔脑组织中天然微管蛋白。利用pull-down及免疫共沉淀方法检测全长PrP及PrP蛋白缺失突变体与微管蛋白是否发生分子间相互作用。结果显示,全长His-PrP23-231能与微管蛋白发生体外相互作用,并首次证实了PrP与微管蛋白相互作用的区域位于PrP N端第23位至91位氨基酸。此研究为进一步研究PrP在神经细胞的主动转运机制以及Prion疾病的发病机制提供了一定的理论基础。     

血管内皮生长因子的神经保护作用

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是内皮细胞特异性的生长因子,大多数关于VEGF的研究都是致力于其在血管生长方面的作用,而近年来有大量文献报道VEGF具有神经营养和促神经发生作用,它能够直接作用于神经元细胞和神经胶质细胞甚至是神经干细胞,促进其生长及存活。VEGF的多种功能使其和多种神经退行性疾病相关,如阿茨海默病,肌萎缩侧索硬化症,帕金森病等。导入VEGF基因能够改善肌萎缩侧索硬化症、帕金森病动物模型的病情。