siRNA介导的NFBD1表达沉默对HeLa细胞增殖与凋亡的影响

NFBD1,也称MDC1,是1个参与细胞内DNA损伤后细胞应答反应的重要分子．为探讨NFBD1在细胞增殖和凋亡中的作用及其作为分子靶点用于肿瘤治疗的潜在价值,本研究采用siRNA技术抑制NFBD1的表达,并观察了其对人宫颈癌细胞HeLa细胞增殖和细胞凋亡的影响．半定量RT-PCR和蛋白质印迹分析结果表明,筛选到的短链NFBD1 siRNA能有效抑制内源NFBD1的表达,抑制程度约100％．细胞生长曲线分析结果表明,siRNA介导的NFBD1表达沉默导致HeLa细胞生长增殖的显著抑制．FACS分析结果表明,NFBD1表达抑制导致sub-G₁峰的出现,同时蛋白质印迹分析观察到了caspase 3和PARP（poly-ADP-ribose polymerase）的剪接激活,表明NFBD1表达抑制诱发了细胞凋亡．在该凋亡过程中,P-53及其下游靶分子Bax和Puma的表达水平均没有发生明显变化,但Noxa的表达在mRNA和蛋白质水平上均显著上调,强烈提示该凋亡过程很可能是1个不依赖P53的凋亡途径,且Noxa的转录激活在该凋亡过程中可能起着重要作用．这些结果表明,NFBD1参与细胞生长增殖和凋亡的调节,是一个潜在的肿瘤治疗新靶点．     

双歧杆菌对SD大鼠空肠黏膜分泌型免疫球蛋白A的影响

目的研究双歧杆菌的免疫佐剂效应。方法将SD大鼠随机分成3组,即卵清白蛋白（OVA）组,双歧杆菌＋OVA组和PBS空白对照组。各组给予免疫后,收集长约3cm的空肠,通过免疫组织化学技术和Qwin图像处理系统,对空肠分泌型免疫球蛋白A（sIgA）的定位进行系统分析,研究同时注射OVA和双歧杆菌后对SD大鼠在不同时期空肠中sIgA阳性细胞分泌的影响。结果在免疫后的SD大鼠的空肠内均产生了特异性的分泌型抗体sIgA,其中双歧杆菌＋OVA组显著高于其他2组（P〈0．05）。结论双歧杆菌经胃肠道黏膜免疫可诱导有效的免疫佐剂效应。     

人HAS3启动子的结构与功能初步分析

透明质酸合酶3（hyaluronan synthase 3,HAS3）,是一个参与透明质酸合成的酶分子,在上皮形成和肿瘤转移等过程中起重要作用.为了进一步研究HAS3基因的转录调控机制,本研究克隆鉴定了HAS3基因的启动子.首先应用5′RACE（rapid amplification of cDNA ends,cDNA末端快速扩增）技术鉴定了HAS3基因的转录起始位点,发现了丰度和转录起始位点不同的两种新的HAS3基因剪接变异体.通过PCR定向克隆策略,构建了覆盖HAS3基因5′端侧翼区起始密码子ATG上游约4.3 kb区域的一系列HAS3基因启动子荧光素酶报告基因重组体.启动子活性分析表明,HAS3基因启动子定位于转录起始位点附近约450 bp的区域内.转录因子结合位点分析表明,HAS3基因启动子缺乏典型的TATA盒,但含有典型的GC盒以及C/EBP等其它潜在的转录因子结合位点. 结果提示,Sp1和C/EBP等转录因子可能参与HAS3基因的转录调控.     

携带人NFBD1基因shRNA重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

建立逆转录病毒介导的NFBD1基因RNA干扰表达体系,并观察其在宫颈癌SiHa细胞中对NFBD1表达的影响.将人NFBD1基因RNA干扰双链DNA片段重组到pSUPER Retro质粒中,构建携带人NFBD1基因RNA干扰的逆转录病毒载体pSUPER-shRNA-NFBD1,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌细胞株SiHa细胞,并用嘌呤霉素筛选产生稳定的细胞克隆,用实时荧光定量PCR和Westernblotting检测细胞中NFBD1 mRNA和蛋白表达的变化.重组逆转录病毒质粒经测序鉴定正确;逆转录病毒感染SiHa细胞后用嘌呤霉素筛选出稳定的细胞克隆;实时荧光定量PCR和Westernblotting检测人NFBD1 mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组.携带人NFBD1基因RNA干扰双链DNA片段的逆转录病毒感染SiHa细胞后能明显抑制NFBD1 mRNA和蛋白表达,为进一步研究NFBD1在宫颈癌中的作用奠定了基础.     

MCHR2在豚鼠大脑组织内的表达

肥胖症是当今危急人类健康的一大难题.研究肥胖的机制,并达到防御和治疗肥胖症是研究的最终目的．自2001年以来,研究发现,黑色素浓集激素受体2（melanin-concentrating hormone receptor-2, MCHR2) 与肥胖间存在紧密联系.但研究进展缓慢,主要瓶颈是没找到合适的动物模型．本课题通过对多种动物的筛选,首次发现豚鼠大脑中存在MCHR2的高度表达,并运用RT-PCR、Northern印迹和Western 印迹等方法进行了验证.这一结果为将豚鼠作为MCHR2功能研究的动物模型提供了实验依据．     

人β3肾上腺素受体激动剂快速筛选模型的建立

目的:β3肾上腺素受体 (beta-3 adrenergic receptor,ADRB3)是β肾上腺素受体的一个亚型,是一个公认的减肥药和抗2型糖尿病药物研发的重要分子靶点,构建其激动剂筛选模型具有重要意义.方法:以ADRB3发挥作用的细胞内信号通路为理论依据,在细胞水平上构建了以荧光素酶为报告基因的人ADRB3激动剂药物筛选模型,并对部分实验条件进行了快速简易优化.结果:已知的ADRB3激动剂异丙肾上腺素和倍他福林均能够有效激活该筛选模型中pCRE-luc报告基因质粒的表达,使其表达增加3倍以上.结论:该筛选模型构建成功.目前该模型已用于以ADRB3为靶点减肥新药筛选.     

UHRF1通过miR-206调控ERα表达促进甲状腺乳头状癌细胞增殖、侵袭和迁移

该研究探讨了泛素样含PDH和环指域1(UHRF1)对甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)细胞增殖、侵袭和迁移的影响。应用Real-time PCR检测正常甲状腺细胞Nthyori3-1、甲状腺乳头状癌细胞BCPAP和K1中UHRF1 mRNA、miR-206和ERαmRNA的表达水平;Real-time PCR检测UHRF1过表达或干扰对miR-206和ERαmRNA的表达影响;MTT、Transwell检测UHRF1过表达或干扰对Nthy-ori3-1、BCPAP、K1细胞增殖、侵袭和迁移影响;Western blot和双荧光素酶报告实验分析miR-206与ERα的靶向关系。结果表明,与Nthy-ori3-1细胞相比,BCPAP和K1细胞中UHRF1 mRNA和ERαmRNA表达水平显著增高(P<0.05),而miR-206表达水平显著降低(P<0.05);UHRF1过表达或干扰处理细胞后,miR-206表达水平与之变化趋势相反,而ERα表达水平与之变化趋势相同;UHRF1促进Nthy-ori3-1、BCPAP和K1细胞增殖、侵袭和迁移;Western blot和双荧光素酶报告实验证实,miR-206靶向ERα基因并抑制其表达。以上结果说明,UHRF1可通过miR-206调控ERα表达,促进甲状腺乳头状癌细胞增殖、侵袭和迁移。     

敲减人MCHR2基因抑制CHO细胞的放射性 配体受体结合能力及Ca 2+释放

研究人黑色素浓集激素受体2(MCHR2)基因特异的小发夹RNA(shRNA)真核表达载体pGenesil-1-MCHR2-shRNA对MCHR2表达及特征的影响.将pGenesil-1-MCHR2-shRNA转染到稳定表达人MCHR2基因的CHO细胞中,通过RT-PCR和 Western印迹检测MCHR2表达的变化;放射性配体结合实验（RBA）检测受体最大结合容量B _max及平衡解离常数K_d值的变化;钙流检测实验观察配体MCH刺激后单个细胞Ca ²⁺释放及MCH半数有效浓度EC₅₀的变化.与转染pGenesil-1空载体组比较,pGenesil-1-MCHR2-shRNA 能使MCHR2基因mRNA表达减少45.8％～66.4％;蛋白表达减少44.2％～81.0％; B _max减少39.4％～78.7％,K_d值升高40.9％～81.9％;EC ₅₀升高114.8％～822.4％.MCHR2基因shRNA真核表达载体能有效抑制MCHR2基因的表达,减少B_max、升高K_d值及EC ₅₀,从而对MCHR2生物活性等特征产生影响.     

巨噬细胞冠蛋白-1 siRNA对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

巨噬细胞冠蛋白-1(Coronin-1)与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)逃逸免疫杀伤有关。该研究探讨了p S-EGFP-SP-Coronin-1si RNA重组质粒靶向抑制巨噬细胞Coronin-1表达后对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响。用该质粒转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,采用RT-PCR法和Western blot检测质粒转染前后细胞Coronin-1的表达水平。以耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)分别感染转染质粒组细胞和对照组细胞,通过细胞内细菌菌落计数和细胞爬片抗酸染色法评估巨噬细胞转染质粒前后对细菌的吞噬能力;利用流式细胞术检测转染质粒组细胞及对照组细胞吞噬耻垢分枝杆菌后不同时段的细胞凋亡水平。结果显示,该质粒能显著抑制RAW264.7细胞Coronin-1的m RNA水平及蛋白表达水平;感染耻垢分枝杆菌6 h后,转染质粒组细胞内细菌数显著高于对照组细胞(P0.05);感染耻垢分枝杆菌48 h后,转染质粒组细胞凋亡水平显著高于对照组细胞(P0.05)。以上结果表明,p S-EGFP-SP-Coronin-1si RNA重组质粒能显著抑制巨噬细胞Coronin-1的表达,并可显著促进巨噬细胞吞噬细菌和凋亡杀菌,为开发靶向巨噬细胞Coronin-1的抗结核基因治疗措施奠定基础。     

血小板衍生生长因子受体β对骨肉瘤细胞株HOS增殖的影响

血管形成是肿瘤生长过程中不可或缺的因素。血小板衍生生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor, PDGFR)通过与其配体结合刺激新生血管形成,与多种肿瘤的发生发展密切相关。研究表明其亚型PDGFRβ高表达于大多数骨肉瘤病人标本及细胞株中,促进肿瘤增殖,但具体机制仍未明确。在本研究中,分别对HOS骨肉瘤细胞株进行特异性配体PDGFBB刺激处理及小干扰RNA (siRNA)敲降PDGFRβ处理,然后检测其增殖、细胞周期及相关蛋白的表达。结果表明:经过PDGFBB刺激后细胞增殖能力增强;细胞周期结果显示处于G1期的HOS细胞数量增多,S期和G2/M期细胞数量减少,G2期相关蛋白Cyclin B1和CDK1以及G1期相关蛋白CyclinE2和CDK2表达增高,提示PDGFBB可能促进了G2/M期转化。而经siRNA干扰后,PDGFRβ在mRNA和蛋白水平均显示表达量下降;细胞增殖受到抑制。检测细胞周期结果发现在敲降PDGFRβ后,进入S期的细胞数量增加了约9.71%,而G2/M期的细胞数量约减少了6.78%,S期相关蛋白Cyclin A1和CDK2明显降低,提示发生了S期阻滞。因此我们推测,PDGFRβ通过调控细胞周期进程影响骨肉瘤细胞的增殖。本研究为PDGFRβ影响HOS细胞增殖及其潜在机制提供了理论依据,为PDGFRβ可以作为治疗骨肉瘤的潜在治疗靶点提供了理论依据。