在DH5α中拼接构建ADAM10全长真核表达载体的基因突变

目的:构建ADAMI0真核表达载体,为进一步研究其生物学功能打基础.方法:将人ADAM10的上下两部分基因片段(分别为全长基因的1 ～910bp和911 ～2 247bp片段),依次与真核表达载体pcDNA3.1相连,以大肠杆菌DH5α或BL21(DB)作为感受态宿主菌用于转化连接产物,拼接成全长的阳性克隆通过PCR、酶切和测序鉴定.结果:ADAM10下段基因与已正确连入上段的pcDNA3.1重组质粒拼接时,若用DH5α为感受态菌,则下半段出现碱基插入增加512bp,测序结果显示为ADAM10基因第1 531 bp～2 042 bp间的序列有紧邻的双份;若用BL21(DE3)为感受态,则无突变.结论:将ADAM10基因与pcDNA3.1真核表达载体依次拼接构建重组质粒时,以DH5α为宿主菌可出现基因序列增加的罕见突变,而以BL21(DE3)为宿主则无突变,由此成功构建ADAM10全长基因与pcDNA3.1的重组质粒.     

Kozak序列(+4G)对携带EGFP标签的人淀粉样前体蛋白751在CHO细胞中表达的影响

目的:观察Kozak序列(+4G)对稳定转染的人淀粉样前体蛋白(hAPP751)-EGFP融合真核表达载体在CHO细胞中表达的影响,为APP的水解代谢研究提供细胞模型。方法:分别将含Kozak序列(+4G)和不含Kozak序列的hAPP751全长基因片段亚克隆入pEGFP-N1表达载体,得到pEGFP-hAPP751(+4G)和pEGFP-hAPP751重组质粒,转染CHO细胞,通过G418筛选稳定转染细胞株,再用倒置荧光显微镜挑取绿色荧光强的细胞进行亚克隆,并观察融合蛋白的表达强度和细胞定位,最后用EGFP抗体通过Western印迹检测融合蛋白。结果:PCR、酶切和测序证明将含Kozak序列(+4G)和不含Kozak序列的hAPP751全长基因片段分别连入了真核表达载体pEGFP-N1中;荧光显微镜下观察pEGFP-hAPP751(+4G)稳定转染细胞的细胞膜和细胞质产生较强的绿色荧光,其中在细胞质中成不均匀颗粒状分布,Western印迹检测到相对分子质量约156 000的融合表达蛋白,与预期相符;pEGFP-hAPP751转染细胞,其绿色荧光十分微弱且在整个细胞均匀分布,Western印迹检测到相对分子质量约26 000的EGFP,但检测不到预期的hAPP751-EGFP融合表达蛋白。结论:Kozak序列(+4G)可以明显促进hAPP751的表达,获得稳定转染且高水平融合表达hAPP751-EGFP的细胞株。     

叉角厉蝽对冷冻饲料黄粉虫蛹的适应性研究

叉角厉蝽Eocanthecona furcellata是农林业重要的天敌昆虫,其替代饲料黄粉虫蛹在饲养中常出现蛹期较短、蛹量过剩的问题。为提升黄粉虫蛹的利用效率,本文探究了-18℃冷冻蛹作为叉角厉蝽饲料可行性,测定了不同冷冻时间处理（1~180 d）后其营养成分的变化,通过计算营养摄入量与种群生命表构建,评价冷冻蛹作为替代饲料与黄粉虫幼虫和活蛹的繁育效果。结果发现,-18℃冷冻30 d以上会显著降低黄粉虫蛹的蛋白质和脂肪含量。取食冷冻蛹的叉角厉蝽种群,除成虫前期显著延长外,其余生物学指标与取食活蛹条件下无显著差异;与取食幼虫的种群相比,其净生殖率R0（94.60头）、周限增长率λ（1.1111 d-1）和内禀增长率r（0.1053 d-1）更高。研究表明经-18℃冷冻7~14 d的黄粉虫蛹仍具有较高的营养价值,叉角厉蝽对其有较好的摄食和繁殖适应性,适度冷冻储存黄粉虫蛹可以用于叉角厉蝽的替代猎物。研究结果为叉角厉蝽的规模化和标准化繁育提供理论依据。