无缝克隆技术的研究进展

DNA克隆技术是分子生物学和基因工程研究必备的工具之一,但传统的以限制性内切酶酶切/连接为手段的克隆技术存在依赖限制性内切酶、连接效率低、耗时长和引入额外序列等缺点。近年来,无缝克隆技术发展迅猛,大量商业化克隆试剂盒也趋于成熟并在实验室被广泛应用,有力推动了蛋白质工程以及合成生物学的发展。本文从无缝克隆原理出发,对近年来发展出来的基于外切酶、PCR技术、同源重组、热稳定的连接酶等原理的无缝克隆技术进行了分类和讨论。特别是新酶资源的不断发现,如核酸外切酶XthA、FnCas12a突变体,与现有技术的相互融合,如Rec/ET重组和核酸外切酶共同使用,将有力推动无缝克隆技术的发展。     

木糖发酵生产高纯度D-乳酸大肠杆菌工程菌LHY02的构建

高效利用木糖发酵生产D-乳酸或其他生物质产品,是充分利用木质纤维素的一个关键问题。以高效利用木糖产L-乳酸的Escherichia coli WL204为出发菌株,采用RED基因置换技术将ldhL基因置换为ldhA基因,获得一株能利用木糖产D-乳酸的大肠杆菌工程菌株Escherichia coli LHY02,该菌株利用10%木糖发酵,D-乳酸产量达到84.4 g/L,产物光学纯度达到99.5%。此外,该菌株仍然具有较好的利用葡萄糖产D-乳酸的能力。     

黑曲霉As3.4309发酵转化芦丁的研究

目的:利用黑曲霉As3.4309发酵产酶,对芦丁的二元糖苷链进行水解,以得到苷元槲皮素.方法:研究黑曲霉As3.4309的最佳产酶条件,对芦丁进行生物转化;用凝胶层析进行转化产物的分离纯化,核磁共振法鉴定其结构.结果:黑曲霉As3.4309发酵转化芦丁的最佳条件:pH为7.0,碳源为3%稻草粉、2%麸皮,氮源为0.5%硫酸铵、0.5%蛋白胨,KH2PO4 3.0mg/mL,MsSO4·7H2O 0.5mg/mL,FeSO4·7H2O 7.5mgL,MnSO4·H2O 2.5mg/L、ZnSO4 2.0mg/L、CoCl2 3.0mg/L,温度30℃,转速180r/min,接种量10%.主要转化产物经过鉴定为槲皮素.结论:该方法简单方便,有效地实现了芦丁的转化,转化产物槲皮素的转化率达到54.36%.