优化CD115稳定性因素以精确检测小鼠单核细胞及其亚群

单核细胞是机体防御系统的重要组成部分,单核细胞数量发生改变一定程度上可反映机体炎症或其他疾病状态。应用流式细胞术对单核细胞表面抗原进行检测,可了解单核细胞占比变化,有助于揭示单核细胞在疾病发生和转归中的作用。鉴于小鼠单核细胞特异性抗原CD115的稳定性较差,在流式检测过程中,对其影响因素进行优化,以确保检测结果的准确性。首先,探讨CD115抗原-抗体结合前后温度和放置时间对其影响及多聚甲醛（paraformalclehyde,PFA）固定对CD115稳定性的保持作用。在此基础上,通过组合流式抗体CD11c、 CD49b、 Ly6G、 Ter119、 CD3e 和 B220选定阴性细胞群,再用CD11b和CD115圈门得到双阳性的单核细胞,最后根据Ly6C表达强弱区分单细胞亚群。结果显示,温度和放置时间对小鼠单核细胞CD115的稳定性影响显著。将小鼠样本在冰上放置6 h时,CD11b和CD115双阳性细胞比例仍保持稳定,在室温放置1 h即明显下降,在37 ℃放置0.5 h则大部分消失。该结果在抗体结合前后趋势一致。PFA固定后,在4 ℃条件下避光保存, CD11b和CD115双阳性细胞比例可稳定保持3 d。在此优化条件下,应用组合抗体可较好地分析小鼠单核细胞及其亚群,为精准检测小鼠单核细胞提供了技术支持,并为进一步研究单核细胞生物学特性及其在疾病中的作用提供了可能。     

抗体滴定在血液细胞流式细胞术中的应用

流式细胞术（flow cytometry）可以实现高速、逐一的细胞定量分析和分选，是研究和诊断血液病的重要手段之一。但是由于不同实验所用细胞和实验条件不同，经常存在抗原阴性细胞非特异染色等问题。利用抗体滴定法，可通过计算、比较染色指数，得到使抗原阳性细胞群和阴性细胞群达到最佳分离效果的实验条件。为了优化血液细胞流式细胞术中荧光抗体染色的实验条件，以小鼠骨髓细胞为被标记细胞，选择利用非串联荧光染料FITC标记的大鼠抗小鼠CD11b抗体（FITC Rat Anti-Mouse CD11b）和串联荧光染料APC-eFluor780标记的大鼠抗小鼠CD11b抗体（APC-eFluor780 Rat Anti-Mouse CD11b）进行标记。通过计算不同浓度抗体标记小鼠骨髓细胞的染色指数进行抗体滴定，确定合适的抗体浓度区间，进而分析细胞数量、染色时间及固定步骤对抗体染色指数的影响，探究影响血液细胞抗体染色的关键因素。结果显示，FITC Rat Anti-Mouse CD11b和APC-eFluor780 Rat Anti-Mouse CD11b的浓度分别在0.156~2.500 μg·mL-1和0.25~1.00 μg·mL-1范围内染色指数较高，但是超出这个范围的抗体浓度会使染色指数降低；抗体浓度、染色时间一定时，FITC Rat Anti-Mouse CD11b和APC-eFluor780 Rat Anti-Mouse CD11b分别在细胞数量为1.56×105~5.00×106 cells·管-1和1.56×105~3.12×105 cells·管-1范围内染色指数较高，但是超出这个范围的细胞数量会使染色指数降低；抗体浓度、细胞数量一定时，对于FITC Rat Anti-Mouse CD11b，随着染色时间的延长，染色指数降低，而APC-eFluor780 Rat Anti-Mouse CD11b与之相反；通过比较固定前后染色指数的高低发现，FITC Rat Anti-Mouse CD11b和APC-eFluor780 Rat Anti-Mouse CD11b在固定后染色指数均显著下降（P<0.01和P<0.05）。研究结果提供了一种通过抗体滴定优化流式分析血液细胞的方法，并指出在特定实验中根据抗体滴定结果选择合适的抗体浓度、细胞数量、染色时间和固定步骤对标记血液细胞进行流式检测的研究至关重要。