草地贪夜蛾组织蛋白酶L的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备

【目的】克隆草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的组织蛋白酶L(cathepsin L,CatL)基因,分析该基因的序列特征并制备该酶多克隆抗体,为探析其生理功能奠定基础。【方法】根据甜菜夜蛾Spodoptera exigua的组织蛋白酶L基因开放阅读框(ORF)序列两端直接设计引物克隆草地贪夜蛾组织蛋白酶L基因。利用生物信息学软件分析该基因的序列特征,利用ClustalX2软件进行同源比对和进化分析,利用同源建模预测该酶三维结构。通过原核表达重组蛋白,多次免疫新西兰大白兔制备该酶多克隆抗体。【结果】克隆获得了草地贪夜蛾的组织蛋白酶L基因SfCatL(GenBank登录号:HQ110065),ORF序列长1 035 bp,编码344个氨基酸,预测N-末端含有长度为16个氨基酸残基的信号肽序列,去除信号肽序列后,预测成熟蛋白分子量为36.8 kD,等电点为6.69。SfCatL氨基酸序列与其他13个物种的组织蛋白酶L氨基酸序列比较有53.7%~96.8%的一致性,与甜菜夜蛾组织蛋白酶L氨基酸序列一致性最高,达96.8%。同源建模预测表明,SfCatL折叠成紧密而稳定的元宝状结构,含3个对结构有稳定作用的二硫键,亲水性氨基酸主要包被在蛋白的表面。原核表达、纯化SfCatL蛋白制备抗血清,其效价超过1∶40 000,Western blot鉴定结果表明抗血清与草地贪夜蛾Sf9细胞SfCatL蛋白能够特异性结合。【结论】获得了草地贪夜蛾SfCatL完整ORF序列,分析了其特征,经原核表达、纯化获得高纯度的融合蛋白,成功获得多克隆抗体。本研究为进一步研究该基因的功能并开发组织蛋白酶抑制剂类杀虫剂提供理论依据。     

草地贪夜蛾组织蛋白酶B的基因克隆、序列分析、三维结构预测及其分子对接模拟

昆虫组织蛋白酶B(Cathepsin B)在昆虫发育和代谢过程中发挥重要作用。本研究首先克隆了草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(J.E.Smmith)的组织蛋白酶B基因Cathepsin B(SCB),获得其开放阅读框(ORF)序列(Gen Bank登录号:HQ110064)。生物信息学分析表明,该基因的开放阅读框包含1 026 bp的片段,编码341个氨基酸,预测N-末端含有长度为20个氨基酸残基的信号肽序列,去除信号肽序列后,预测成熟蛋白分子量为35.6 k D,等电点为6.59。氨基酸序列与15种物种Cathepsin B比较有51.2%-96.2%的一致性,与甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hiibner)相似度最高,达96.2%。利用同源建模预测SCB的三维结构,经动力学的优化,SCB折叠成紧密而稳定的球状结构,含6个对结构有稳定作用的二硫键,亲水性氨基酸主要包被在蛋白表面。同时分子对接模拟结果表明,SCB结合口袋比较浅,形状不规则,袋口较宽。ARG19、VAL23和ASN24为活性位点关键氨基酸残基,抑制剂CA与SCB活性位点3个关键氨基酸残基有较强的相互作用,且均主要表现为静电相互作用能,其中VAL23、ASN24与CA形成氢键。以期为进一步运用生物实验手段研究Cathepsin B的结构和功能,设计和开发昆虫组织蛋白酶类抑制剂类杀虫剂奠定基础。