Sulfolobus acidocaldarius DHH超家族核酸酶Saci0542的酶学特征研究

【目的】以嗜酸嗜热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius的DHH超家族核酸酶（Saci0542）为例,研究其核酸外切酶活性特点,为阐明其在DNA代谢中的具体功能提供生化基础。【方法】将嗜酸嗜热硫化叶菌DHH超家族核酸酶Saci0542基因在大肠杆菌中重组表达,经亲和层析纯化得到电泳纯的重组蛋白;利用荧光标记的寡核苷酸作为底物,用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,鉴定Saci0542的酶学特征。【结果】重组表达的DHH超家族核酸酶Saci0542具有典型的单链核酸特异性的3’-5’外切酶活性。进一步酶学特征表征结果如下:酶活性依赖于二价金属离子Mn²⁺,而Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺等二价金属离子对活性没有明显的促进作用;Saci0542在pH5.5–10的广泛范围内均表现出较高酶活性;高于200 mmol/L的NaCl强烈抑制酶活性;最适反应温度为50–55℃;末端磷酸基团抑制3’-5’外切酶活性。【结论】本研究证实,Saci0542是一种Mn²⁺依赖型3’-...     

超嗜热古菌Thermococcus eurythermalis A501编码B家族DNA聚合酶的生化特性及PCR应用

DNA聚合酶广泛应用于PCR技术,在生命科学研究及相关领域发挥重要作用。但目前商业化DNA聚合酶仍不能完全满足科研需要,有必要寻求高性能DNA聚合酶。文中克隆表达了超嗜热古菌（Thermococcus eurythermalis）A501来源的B家族DNA聚合酶基因（NCBI数据库基因登录号为TEU＿RS04875）、表征该重组蛋白的生化特性、评价了其PCR应用。将删除intein蛋白序列的DNA聚合酶（Teu-PolB）进行体外重组表达,经亲和层析和离子交换层析纯化获得Teu-PolB蛋白;利用5′端带荧光标记的寡核苷酸作为底物,用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定Teu-PolB的生化特性;以噬菌体λDNA基因组为模板,探究Teu-PolB的PCR应用。结果显示,Teu-PolB具有DNA聚合酶活性和3′→5′核酸外切酶活性,该酶在98℃下的半衰期约为2 h,热稳定性高。使用Teu-PolB进行PCR扩增,最适PCR缓冲液为50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0,2.5 mmol/L MgCl₂,60 mmol/L KCl,10 mmol/L （NH<...     

外源载体高效转化肺炎克雷伯菌的新途径

研究介绍了提高Klebsiella pneumoniae电转化效率的新途径,即直接从固体平板上收集K.pneumoniae菌落制备电转化感受态细胞,完全不同于传统的试验方法。试验菌株为野生型K.pneumoniae NTUH-K2044和magA—突变型菌株。将大小不同的质粒pIP843T、pIP843TdhaB、pIP843TdhaT电转化K.pneumoniae,计算电转化效率。电转化试验结果表明:K.pneumoniaeNTUH-K2044固体菌电转化效率高达2×105±300转化子/μgDNA,而其液体菌电转化效率仅为150±10转化子/?gDNA;其magA—突变株固体菌的转化效率最高,可以达到3.4×107±500转化子/μgDNA,比液体菌电转化效率提高了104倍。同时发现质粒大小对电转化效率并没有明显影响。此外,激光共聚焦显微镜观察发现固体平板和液体培养基中的菌体存在形态学方面差异,推测固体培养菌电转化效率的显著提高和形态学方面的表现可能具有一定的相关性。     

嗜酸嗜热古菌Sulfolobus acidocaldarius编码尿嘧啶DNA糖苷酶表达，纯化与酶学特征

摘要:【目的】嗜高温微生物面临dC脱氨基生成dU损伤的巨大压力,鉴定嗜酸嗜热古菌S.acidocaldarius来源的尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)切除dU损伤的酶学活性。【方法】重组表达来源于S.acidocaldarius的IV和V型UDG,经亲和纯化得到电泳纯重组蛋白。然后利用人工合成的dU(deoxyuracil)修饰寡核苷酸片段作为底物,体外鉴定两种重组UDG 的酶学特性。【结果】来源于S.acidocaldarius的IV和V型重组UDG具有相似的酶学特性。IV型UDG催化效率更高,比活性是V型重组UDG的750倍左右。作为来自嗜热微生物 的蛋白,S.acidocaldarius的IV和V型UDG的最适反应温度为65－75℃。【结论】IV型UDG比V型UDG水解dU碱基和脱氧核糖之间糖苷键的能力更强。     

火球菌Pyrococcus furious瓣状核酸内切酶1的表达纯化及酶学特征

【目的】克隆表达和纯化火球菌Pyrococcus furious来源的瓣状核酸内切酶1基因pFEN1(PF1414),对该蛋白的活性和酶学特征进行鉴定和分析。【方法】将pFEN1在大肠杆菌中进行重组表达,经亲和层析纯化得到电泳纯蛋白;利用人工合成的荧光标记的寡核苷酸片段作为底物,用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定pFEN1在体外的酶学特性以及与其他蛋白的相互作用。【结果】pFEN1重组蛋白能在大肠杆菌中进行高效表达;高于100 mmol/L的NaCl会抑制pFEN1的活性;pFEN1的核酸酶活性依赖于金属离子Mg~(2+)或Mn~(2+),且Mn~(2+)的催化效率优于Mg~(2+);来自嗜热古菌的pFEN1是一种耐高温蛋白,最适反应温度为60–65°C;增殖细胞核抗原(PCNA)能促进pFEN1的内切酶活性。【结论】本研究证实pFEN1是一种Mg~(2+)或Mn~(2+)依赖的核酸内切酶,且PCNA能促进该酶的活性。     

一种基于线性DNA片段同源重组的嗜盐古菌高效基因敲除系统

随着功能基因组学研究的深入发展,基因敲除技术日益成为基因功能研究的重要手段。嗜盐古菌Haloferax volcanii易于培养,是研究古菌基因功能的良好模式菌株。虽然现已开发了多种嗜盐古菌的遗传操作系统,但基因敲除成功率不十分理想。这些遗传操作方法基于pyrE筛选标记,利用携带同源片段的环状质粒与基因组同源片段间的两次同源重组,敲除目的基因。由于基于环状质粒和pyrE筛选标记的经典同源重组敲除方法在二次重组时,普遍存在回复到野生型菌株的可能,导致二次重组子中敲除目的基因的阳性菌株比例较低。为了克服传统同源重组技术的上述缺陷,文章建立了基于线性DNA片段的同源重组技术。该方法通过一次重组在目标基因的下游引入一段上游同源片段和pyrE标记,从而限定二次重组的发生部位只能在两段上游同源片段之间,发生二次重组的重组子理论上都敲除了目标基因。利用该方法,文章成功敲除了嗜盐古菌Haloferax volcanii的xpd2基因,阳性克隆率达65%。这种线性DNA片段重组法为嗜盐古菌的基因敲除提供了一种高效策略,便于嗜盐古菌的基因改造。     

嗜热古菌Sulfolobus acidocaldarius核酸内切酶V的重组表达与酶学特征

[目的] 表达纯化嗜酸嗜热硫化叶菌（Sulfolobus acidocaldarius）的核酸内切酶V （Saci_0544）,对其核酸内切酶活性及酶学特征进行探究。[方法] 将Sulfolobus acidocaldarius核酸内切酶V （SacEndoV）在大肠杆菌中进行重组表达,经亲和层析纯化得到目标蛋白;利用带有不同类型损伤的寡核苷酸作为底物,结合变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,鉴定SacEndoV对相应损伤寡核苷酸底物的剪切活性。[结果] SacEndoV特异性剪切含脱氧肌苷（Deoxyinosine）的损伤DNA底物,明显偏好单链DNA底物。SacEndoV在70-95℃温度范围内酶活性高,酶活性依赖于二价金属离子,Mg²⁺为最佳辅助离子,其最佳反应pH为7.5-8.0,高于200 mmol/L的NaCl会明显抑制其剪切活性。损伤DNA中脱氧肌苷3''端相邻的脱氧核糖核苷酸的结构完整性对于SacEndoV识别并剪切相应底物具有重要影响,脱氧肌苷3''端无碱基位点的存在使得SacEndoV不能够切断损伤DNA。此外,经测定SacEndoV对于含肌苷的损伤RNA底物具有剪切活性。[结论] 本研究证实SacEndoV是一种典型的核酸内切酶V,对含脱氧肌苷的损伤DNA具有特异性的内切酶活性,推测其在Sulfolobus acidocaldarius体内参与脱氧肌苷的切除修复。     

植物乳杆菌环二腺苷酸合成酶的克隆表达与活性分析

【背景】环二腺苷酸(Cyclic Diadenosine Monophosphate,c-di-AMP)是一种主要存在于革兰氏阳性菌中的重要的第二信使分子,其参与细菌的生长、生存、抗逆性等多种生理活动,但目前关于乳酸菌中c-di-AMP的研究甚少。【目的】从植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中克隆得到c-di-AMP合成酶基因,在大肠杆菌中进行可溶性表达并研究其体外活性。【方法】使用高效液相色谱以及质谱分析对植物乳杆菌-YRA7细胞内容物中的c-di-AMP进行检测;以植物乳杆菌-YRA7基因组DNA为模板,克隆c-di-AMP合成酶基因(lpDacA),构建重组表达载体pET-28a-lpDacA并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析纯化后进行体外活性研究。【结果】在植物乳杆菌中检测到c-di-AMP分子;成功构建了c-di-AMP合成酶基因的重组表达质粒,该重组蛋白在大肠杆菌中得到可溶性表达;体外活性分析显示,该重组蛋白可以催化ATP生成c-di-AMP,其活性依赖于二价阳离子的存在,在Mg~(2+)存在以及碱性环境下活性较强;RHR是合成酶活性的关键基序,是环二腺苷酸合成酶与ATP的结合位点。【结论】植物乳杆菌c-di-AMP合成酶的克隆表达及活性分析为进一步研究c-di-AMP在植物乳杆菌中的作用奠定了基础。     

RNase A及其链亲和素融合蛋白在pET系统中的表达

在大肠杆菌中用pET28a表达载体表达重组RNaseA。变性条件下,利用His-Resin亲和纯化,得到60mg／L电泳纯的RNaseA。纯化的RNaseA复性后,利用含大量RNA分子的碱法抽提质粒为底物,测定重组RNaseA活性,与商品化的RNaseA活性相当。同时在RNaseA活性测定体系中加入4mol／L尿素会使RNA分子切割效率提高10倍左右。在此基础上,成功表达RNaseA与链亲和素(streptavidjn)的融合蛋白,经纯化复性后,该融合蛋白同时具有核酸酶、biotin结合活性,在分子生物学中具有重要的应用价值。     

嗜热古菌Archaeoglobus fulgidus RecJ核酸酶的表达纯化及酶学特征

[目的]克隆表达嗜热古菌Archaeoglobus fulgidus(A.fulgidus)来源的RecJ核酸酶基因(ORF编号AF_0699,NCBI数据库基因登陆号为AF_RS03550),对该重组蛋白的核酸酶活性及酶学特征进行鉴定和分析.[方法]将A.fulgidus RecJ(AfuRecJ)核酸酶在大肠杆菌中...