重组大肠杆菌热稳定性过氧化氢酶的纯化及性质研究

将产热稳定性过氧化氢酶的重组大肠杆菌培养后菌体破碎得到的粗酶液经热处理、硫酸铵分级沉淀、DEAE\|Sephadex A\|50离子交换层析、HiPrep16/10 Phenyl疏水作用层析、Superdex200 HR 10/30凝胶层析提纯后得到电泳纯的酶,比酶活达到15629U/mg。此酶的最适温度为70℃,最适pH70,在60℃保温60min酶活力基本不变,在pH3～8的范围内比较稳定。此酶的Km和Vmax分别为775mmol/L和278mmol\5min\+\{-1\}·mg-1。1mmol/L的Zn2+、Ba2+、Mn2+可使该酶完全失活,KCN、NaN\-3、Na\-2S\-2O\-4、巯基乙醇对酶活力有抑制作用,50mmol/L的EDTA不影响酶活性。     

弗氏柠檬酸细菌酪氨酸酚解酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

以基因组DNA为模板,利用PCR技术从弗氏柠檬酸细菌（Citrobacter freundii)中扩增得到含有酪氨酸酚解酶基因的DNA片段,定向连续到质粒pUC118上,得到重组质粒pTPL,将此重组质粒转化到受体菌E.colXL-1-Blue MRF′中,通过蓝白斑鉴定挑出阳性菌株。从此阳性菌株中提取质粒pTPL并将此质粒转入到E.coliJM109中,用E.coliJM109（pTPL)制备高活性的酪氨酸酚解酶。对质粒稳定性的研究表明,E.coliJM109（pTPL)在无选择压力下37℃连续培养50代以上,质粒丢失率仅有15％,说明质粒基本稳定。     

枝孢霉丝孢真菌生长特性的研究

为明确枝孢霉丝孢真菌生物学特性,根据枝孢霉属当前分类系统,选取6株代表菌株,通过单因素分析法,研究了不同培养温度、生长pH和培养基中葡萄糖、蛋白胨浓度对该类菌种生长的影响,并通过微量肉汤稀释法检测了 5种常用表面活性剂对该类菌种的最低抑菌浓度.结果表明,6株枝孢霉真菌适宜生长温度为20～25℃,pH为5.0～6.5,葡...     

微生物酶的分子改性和人工进化的研究进展

运用分子生物学技术对微生物来源的酶进行分子改性和人工进化在过去几年中取得了令人瞩目的进展。本文综述了用于酶分子改性和人工进化的主要分子生物学方法,如易错PCR技术、DNA体外随机拼接技术等及其在酶的分子进化和改性中应用成就。     

碱性蛋白酶工程菌发酵条件及重组酶的纯化和性质的研究

在5L发酵罐中对重组碱性蛋白酶工程菌株BP071高产碱性蛋白酶的条件进行了研究,通过提高通气量和改变搅拌转速,BP071可在发酵40 h内达到产酶高峰,酶活力最高可达24480 u/mL。利用快速蛋白液相层析（FPLC）技术,建立了快速高效纯化碱性蛋白酶的方案。发酵液通过硫酸铵沉淀、DEAE-A-50脱色及聚乙二醇浓缩得粗酶,再经过CM-Sephadex-C-50、Sephadex-G-75柱层析后得到了单一组份的重组碱性蛋白酶,酶纯度提高了76.2倍。SDS-PAGE显示重组碱性蛋白酶分子量为28 kD。酶学性质研究表明,酶的最适作用pH为11,最适作用温度为60℃,具有良好的pH稳定性和热稳定性。Ca²⁺、Mg²⁺对酶的稳定性有促进作用,Hg²⁺、Ag⁺、PMFS和DFP能强烈抑制酶的活力。SDS和Urea对酶的活力无影响。