小鼠17β-hsd10的克隆、表达及双抗夹心ELISA方法的建立

原核表达小鼠17β-羟基类固醇脱氢酶(17β-hsd10),制备抗17β-hsd10多克隆抗体,建立17β-hsd10双抗夹心酶联免疫检测方法 (Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)。采用RT-PCR技术克隆得到小鼠肝脏17β-hsd 10基因,构建原核表达体系p ET15b-17β-hsd10/Escherichia coli BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,并优化表达条件;目的蛋白用His融合蛋白纯化柱(His-Binding-resin)纯化并免疫BALB/c小鼠和新西兰大耳白兔,免疫血清总Ig G采用硫酸铵沉淀法纯化,用获得的高效价鼠源和兔源两种多克隆抗体,建立17β-hsd10双抗夹心酶联免疫检测方法。表达蛋白约为29.5 k Da,纯化后浓度为1.5 mg/m L,鼠源和兔源多克隆抗体效价分别为1.25×104和2.5×104,建立的检测方法对于多种羟基类固醇脱氢酶无交叉反应,特异性良好,可检出含量约为0.05-0.1μg/m L的阳性血清。建立的17β-hsd10双抗夹心ELISA方法,简便、快速、敏感,适合实验室研究科研广泛应用。并可能为检测阿尔茨海默病提供新思路和方法。     

降钙素原荧光免疫层析方法的建立

降钙素原(Procalcitonin,PCT)是降钙素的前体物质,与人体细菌感染情况严重程度相关。通过PCT抗体与量子点偶联,自制试纸条,开发一种高灵敏度、快速便捷的PCT检测产品,对其初步应用。PCT单抗效价达107,PCT蛋白与量子点偶联,具有较好稳定性。试纸条线性检测范围0.15–120μg/L,灵敏度0.007μg/L,回收率范围91%–113%,批内批间变异系数小于8%。自制的荧光检测试纸条与市场上已有的降钙素原ELISA试剂盒进行比对,检测结果良好,基本能够完成临床样品的检测。     

阿尔茨海默病转基因小鼠的构建及鉴定

阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)是一种病因不明的原发性脑部神经系统疾病,多以老年斑和神经纤维缠结为特征,已严重威胁人类健康。建立理想的AD动物模型,对研究AD的发病机制以及药物筛选防治AD新药至关重要。将β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)基因整合到C57BL/6J小鼠(Mus musculus)基因组中,20周后取小鼠海马区。蛋白免疫沉淀和免疫组化检测结果显示有淀粉样前体蛋白表达;Y迷宫检测结果显示转基因小鼠记忆力变差,与空白对照组比较下降了18%。阿尔茨海默病转基因小鼠动物模型的成功构建,为进一步研究AD疾病提供了良好的研究基础。