裂解多糖单加氧酶高效催化的研究进展

裂解多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenases,LPMOs)是一类新发现的铜离子依赖性的氧化酶,常具有多种模块化组合,能够高效氧化降解生物质多糖.LPMOs的催化结构域为β三明治结构,活性中心含有一个铜离子.该酶的催化反应过程相对于糖苷水解酶类更加复杂,LPMOs结合底物后,首先要接受电子供体提供的电子,通过电子传递链传递给活性中心的Cu[Ⅱ],将其还原为Cu[Ⅰ],Cu[Ⅰ]结合并活化分子氧后,再氧化降解多糖链的糖苷键,生成氧化产物和非氧化产物.近年来的研究表明,在木质纤维素降解酶系中加入LPMOs能显著提高其对结晶纤维素的转化效率,因此LPMOs相关研究的深入开展可以拓展人们对其高效降解机制的认识,从而为高效降解酶系的复配以降低工业规模的生产成本等提供理论指导.本文综述了该领域相关研究的最新进展,分析了LPMOs潜在的研究方向与工业化应用的前景.     

分批培养条件下细菌群体生长阶段的区分及生长参数的确定

用样条插值法光滑实测数据后, 再用数值微分法对分批培养条件下细菌群体生长过程进行分析, 由此提出了区分群体生长阶段的新方法: 依据瞬时生长速度和瞬时生长加速度规律性的变化, 把细菌群体生长过程区分为加速生长期、恒速生长期、减速生长期和衰亡期四个阶段. 进一步应用Gaussian函数方程进行拟合, 得到新的生长参数. 测定了群体生长过程中DNA含量, 对其倍性变化的特点进行了讨论. 将新的表征群体生长的建模方法(Spline-Numerical-Gaussian, SNG)与依据Logistic方程划分生长阶段的传统方法作了比较, 并对SNG方法的生物学内涵作了进一步讨论.     

快速展示糖苷水解酶活性架构单点突变导致结合力变化的电泳技术

酶分子在长期进化过程中形成一系列氨基酸残基组成的活性架构,参与底物的识别、结合与催化过程,而活性架构中相应氨基酸残基是如何影响酶分子结合底物的能力,进而影响酶分子的催化效率,一直是酶分子理性改造研究的热点.利用亲和电泳技术,可以快速展示内切纤维素酶Tr Cel12A和木聚糖酶Tl Xyn A活性架构中不同突变体的催化活性及其迁移率的变化,进而通过在不同底物浓度凝胶中蛋白质相对迁移率变化程度的定量回归分析,发现由氨基酸单点突变导致蛋白质迁移率的相对变化,可以定量表征酶分子突变前后结合底物能力的变化.亲和电泳测定的有效阻滞常数Kb值与等温滴定量热法和荧光光谱法测定的相关参数比较具有明显相关性.由于亲和电泳技术在测定酶分子与底物的结合能力时具有简便、快速、灵敏的特点,因而可作为常规生化实验室常规普筛技术来检测突变文库中系列突变体导致结合力的变化.     

检测大肠杆菌群体生长动力学过程4种方法的比较

用浊度测定、菌落形成数计数（CFU）、流式细胞计数（FCT）,以及MTT还原测脱氢酶活力4种检测方法,测定了E．coliCVCC249群体的生长量,并通过Logistic模型、Sigmoid模型,以及正态分布方程拟合由上述生物量所表征的群体生长动力学过程曲线．结果表明,对浊度和流式检测数据,Logistic和Sigmoid方程可给出较好的拟合度,而对CFU法和脱氢酶活力检测法,仅有正态分布方程能呈现更好的拟合．通过应用有限时域向前差分的方法,消除不能增殖的休止细胞对浊度生长过程曲线的影响,以模拟菌群增殖的过程曲线．在此基础上,求得菌群生长的即时速度（advancingvelocity,Vad。）和即时速度的瞬变率,以此为据将E．coliCVCC249生长过程划分为线性增长期、指数增长期、指数减速期、线性减速期,以及衰亡期5个阶段．此外,对新的划分生长阶段的方法与经典方法的不同,以及R。（拟合决定系数）能否作为确定模型是否拟合的唯一判据,进行了讨论．     

大肠杆菌群体的生理异质性对药敏实验的影响

E. coli CVCC249分批培养的过程根据菌群瞬时生长速率的变化分为加速生长期、恒速生长期、减速生长期和衰亡期4个阶段. 各阶段分别取样, 测定抗生素浓度-杀菌曲线(concentration- killing curve, CKC), 结果表明菌群的生理异质性导致菌群个体间的药物敏感性不同, 总体呈现正态分布. 检测表明各阶段中菌群的核酸、蛋白质含量和脱氢酶活力都有明显差别, 这种生理异质性导致各阶段菌群对药物敏感性的差异. 以加速生长期菌群的CKC曲线为参照, 对于庆大霉 素, 恒速生长期和衰亡期菌群敏感性增强; 对于恩诺沙星恒速生长期反而减弱, 其他阶段差别不大. 这是常规药敏实验方法难以显示的, 表明对不同生理状态菌群的药敏实验测定结果可深入反映出药物的杀菌机理. 这有助于常规药敏实验方法的改进, 并可为抗菌药物的合理使用提供理论支持.     

大数据时代杂合酶的设计及其新趋势

酶分子的高效性和稳定性是工业广泛应用的物质基础。利用分子生物学技术可以将不同酶分子通过串联、插入、翻译后融合等方式构建成符合工业需求的杂合酶,但应用中多结构域杂合酶在表达量与酶活等方面仍存在弊端,而基于特定蛋白质结构域的多功能设计成为新趋势。高通量测序技术的发展,使得生物学家正面临着爆炸式增长的大数据集。近年来"蛋白质功能区"概念的提出,拓宽了人们对蛋白质结构与功能组织层次的认知,功能区残基聚簇的协同演化可导致同一家族不同蛋白质功能的差异。基于海量大数据分析可以快速定位特定功能区以及协同进化的关键位点,再利用合成生物学技术就可实现多种功能残基在同一蛋白质中的精准嫁接,完成天然酶分子的再设计。这将是杂合酶技术发展的新阶段,也会成为生物大数据时代下蛋白质设计的新趋势。     

细菌群体异质性对生长动态过程的影响及其表征

在经典的表征群体生长的Logistic方程中, 假定群体中每个个体都是同质的. 解方程时的初值仅限定为N(t₀) = N₀, 因此, 对N₀相同而生理状态不同的接种物的生长动态不能区分. 事实上, 在菌群生长的任一时刻, 只有一定比例的细胞在进行分裂(设为θ), 这样, 不仅由N, 而且实际上由N和θ 共同决定. 因此, 解方程的初值条件还应加入θ (t₀) = θ₀, 而这又被在构建生长方程时所忽略, 但这一附加条件使Logistic方程的求解甚为复杂. 基于细菌生长过程的瞬时生长速率V_inst的时间过程曲线都呈Gauss分布形状这一特点, 在用瞬时生长速率成功地表征限制性条件下区分群体生长阶段的基础上, 进一步用Gauss分布近似函数表达式以求得异质性群体的生长参数, 这些参数可真实地表征不同生理状态细菌群体的生长动态, 为微生物学基础研究和在生物工程等方面的应用提供了一个新方法. 在此基础上提出了一个估算细菌群体生长延迟期和群体倍增时间的新方法.     

生物质多糖的高效降解与降解酶（系）的精确定制

自然界中多糖类生物质资源十分丰富,然而其复杂的抗降解屏障限制了生物转化的进程.近年来,随着生物质多糖结构的快速解析以及大量多糖降解酶的鉴定研究,针对不同底物结构或产物需求,仿制高效微生物多糖代谢途径,精确定制多糖降解酶系,促进生物质高效转化已成为可能.本文分析中性多糖(纤维素和木聚糖)、碱性多糖(几丁质和壳聚糖)以及酸性多糖(褐藻胶)的精细结构组成与基团性质,总结3类多糖主要降解酶的活性架构特征及其底物精确结合模式.文章还阐述蛋白质工程设计与定制策略,针对酶分子不同功能区的分析,可为酶分子的功能快速设计与改造提供靶点,以获得适宜于工业应用的高效酶分子,此外,根据微生物胞外降解酶系的降解次序与协同关系,可基于应用需求精确定制复杂多糖降解酶系,实现生物质的高效与高值降解转化.     

铁摄取调节蛋白Fur功能和作用模式的研究进展

铁是大多数生物必需的微量元素,在健康和疾病,尤其是宿主-病原菌互作过程中发挥着至关重要的作用.细菌胞内铁离子浓度的高低不仅是调节自身高亲和力铁运输系统表达的信号,更是病原菌产生毒素和其他必要毒力因子的关键调控因素.而另一方面,超负荷的铁也会导致致命的细胞毒性.因此,生物体内铁稳态的维持受到严格控制,其中以铁摄取调节蛋白(ferric uptake regulator,Fur)的作用最为显著,其调控网络涵盖了细菌生命活动的各个方面.本综述将基于Fur的生物学功能,围绕其家族分类、结构特点和差异、调控网络和调控机制等方面进行总结和分析,以期为Fur和铁稳态调节等研究提供参考.     

纤维素酶解速度的可视化表征与限制因素分析

纤维素酶解效率是木质纤维素高效生物转化的限制瓶颈,利用原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)可以在水相中原位可视化表征纤维素酶分子运动行为,分析单个酶分子的运动速度及其影响因素.研究发现,高效降解结晶纤维素酶分子仅结合于特定结晶表面上的特定位点上,通过单方向运动完成逐层降解,过量酶分子结合于特定表面上会导致持续性运动"塞车"现象.结晶微纤丝的降解不仅取决于酶分子运动速度及其糖苷键断裂效率,更取决于酶分子可及底物的晶面大小及其晶面氢键解聚程度.以新结合模式、新运动模式或新组织模式的纤维素酶系或复合体应是纤维素酶研究的重点方向.