克隆毒素源性大肠杆菌K88ac抗原基因

E.coli79-l454(08：K88ac K31：H^-)是北京生物制品检定所从上海郊区腹泻的仔猪分离到的野生型毒素源性大肠杆菌,该菌产生K88ac抗原,产生热敏感毒素(LT)和热稳定毒素(sT)。发酵棉子糖,抗四环素,含有50Md的大质粒。用碱变性法提取,以线性cscl-EB密度梯度离心法纯化大质粒,用HindⅢ酶消化,回收6.5Md的片段,与载体pBR322连接,转化到E.coliRRl,选出Ap¹Tc²的转化子,用玻片凝集,琼艚扩散。K88ac抗血清致敏的绵羊红细胞反向间接血凝,被动溶血,ELISA等方法检测K88ac抗原均为阳性的重组体,其中一株命名为E.coliRR1(pMM031),酶切图谱表明除含pBR322 DNA的片段外,还台有约为6．5Md的片段,此片段是HindⅢ酶消化大质粒DNA产生的第二条片段,含有为K88ac抗原基因编码的遗传决定子。用LT基因探针菌落原位杂交,Y—l肾细胞试验等方法检测结果表明重组体不产生LT;用乳鼠试验及STb基因探针杂交均是阴性,说明重组体不产生ST。由此可见重组体产生K88ac抗原,但无毒性,有可能用作疫苗栋,也可以与其他因子配伍构建成更好的活疫苗株。     

比生长速率与培养基成份对rIL-2工程菌生长和表达的影响

基因工程菌高密度培养对提高单位体积培养物的产量,提高生产能力,减轻下游负担均有积极意义。本文对由PL-λCI_(857)温度诱导控制系统控制的rIL 2工程菌的高密度培养,及在高密度时实现较高表达的方案进行了初步研究。发现该菌的高密度生长时有乙酸积累,在升温诱导后乙酸积累加快,乙酸的存在对菌体生长和产物表达均有明显的抑制作用,这种抑制     

rIL-2工程菌诱导阶段细胞再循环培养的研究

为了减少rIL-2工程菌高密度培养时乙酸的积累,在诱导阶段对该工程菌进行细胞再循环培养的研究,比较了细胞再循环补料液、pH、细胞循环培养时间段对工程菌的生长及rIL-2表达的影响。结果表明在菌密度D_(600)为50时,细胞再循环补料液中酵母抽提物与胰蛋白胨浓度为发酵培养基的5倍就能满足rIL-2表达的需求,同时选择诱导后4～6h之间的细胞再循环培养能有效地防止乙酸的过高积累并减少营养物质的损失,有利于rIL-2的表达。根据以上研究结果得到了rIL-2工程菌诱导阶段细胞再循环培养方法,使得在诱导前菌密度D_(600)为50左右时rIL-2的表达水平约为40％。     

霍乱毒素B亚单位工程菌MM2在含乳酸培养基中的高表达

确定了工程菌MM2中霍乱毒素B亚单位(CTB)在含乳酸培养基中的高表达方案。采用两阶段控制培养温度(30℃→37℃)可提高CTB产量4倍,提高后期pH值(72→84)可提高CTB比表达水平214倍,中间补加乙酸钠可提高CTB产量65%。在5L发酵罐培养菌密度OD₆₀₀达30,CTB产量达1867mg/L,产物在培养液中以多聚体形式存在,具有抗原性。     

昆虫病原线虫和噻虫嗪混用对韭蛆的杀虫效果及其体内保护酶和解毒酶活性的影响

【目的】害虫受到病原生物、化学农药作用后,会引起其体内生理生化的变化。本研究旨在阐明昆虫病原线虫和噻虫嗪联合作用下对韭菜迟眼蕈蚊Bradysia odoriphaga幼虫(韭蛆)的杀虫效果及体内保护酶和解毒酶活性的影响。【方法】采用培养皿滤纸法测定了芫菁夜蛾斯氏线虫Steinernema feltiae SF-SN(Sf)(60头/幼虫)与噻虫嗪(15 mg/L)混用对韭菜迟眼蕈蚊3龄幼虫的LT_(50);采用生化分析法比较分析不同时间下两者混用对其幼虫体内酶液蛋白质含量和体内酶[超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)和乙酰胆碱酯酶(AChE)]活性的影响。【结果】Sf与噻虫嗪混用处理韭菜迟眼蕈蚊3龄幼虫,其LT_(50)值为41.05 h,比单独使用Sf(LT_(50):167.93 h)和噻虫嗪(LT_(50):72.82 h)时分别缩短了126.88 h和31.77 h;处理后24-72 h,两者混用时对试虫的校正死亡率均显著高于两者单用,且在处理72 h时,校正死亡率达到96.61%。与对照组相比,两者混用处理后12,24和36 h时,韭蛆体内酶液蛋白质含量分别提高了13.88%,46.87%和57.99%,均显著高于对照组、Sf处理组和噻虫嗪处理组。处理24 h时,两者混用组SOD,CAT,AChE和GTSs活性分别比对照降低了47.48%,28.73%,71.04%和29.97%;处理36 h时,酶活性分别比对照降低了46.34%,42.22%,58.37%和11.87%,均显著低于对照组、Sf处理组和噻虫嗪组,比单剂具有更强的抑制作用。【结论】Sf和噻虫嗪联合作用韭菜迟眼蕈蚊3龄幼虫后,其LT_(50)值比两者单用时显著缩短,且对幼虫体内SOD,CAT,AChE和GSTs活性均具有更强的抑制作用。     

丙肝抗原决定簇与CTB的融合、表达及融合蛋白的纯化

通过固相化学合成法合成了编码丙型肝炎病毒(HCV)结构区和非结构区的4个抗原决定簇基因,这些抗原决定簇基因片段以不同方式串联后与ctxB基因融合,构建了12种表达不同嵌合蛋白的重组质粒,各重组质粒转化大肠杆菌后均能高效分泌性表达融合蛋白,表达产量在10～50μg/ml之间,随所融合的抗原决定簇不同而不同,表达水平主要与抗原决定簇的氨基酸组成有关,而与抗原决定簇的大小及串联次数关系不大。融合蛋白通过亲和层析纯化,达到了电泳纯,为进一步研究融合蛋白的抗原性及用作抗-HCV ELISA诊断试剂抗原打下了基础。     

重组大肠杆菌高密度培养研究进展

大肠杆菌是基因工程中常用的宿主菌,许多有价值的多肽和蛋白在大肠杆菌中已成功地进行了表达,表达水平有些高达细胞总蛋白的３０％以上,为了提高单位体积设备产物的产量,除了提高表达水平外,还需提高重组大肠杆菌的培养密度。大肠杆菌高密度培养的早期工作主要是以宿主菌为模型进行研究的,而近年来,重组大肠杆菌高密度高表达的研究已经有了较大进展。本文着重综述了培养基成分、溶氧、比生长速率和代谢副产物乙酸等因素对工程菌生长和表达的影响,及提高菌密度和表达水平的培养方法。     

1．9A分辨率Al－（L－丙氨酸）胰岛素晶体结构研究

使用Ｘ－ＰＬＯＲ及立体化学制约最小二乘精化技术,并结合差值Ｆｏｕｒｉｅｒ图人工分析,测定了１．９　分辨率Ａｌ修饰丙氨酸胰岛素的晶体结构,晶体空间群为Ｒ３,晶胞参数：ａ＝ｂ＝８０．８９,ｃ＝３７．６４。精化后的结构模型最终偏离因子Ｒ＝０．１８５,同理想键长和键角的均方根偏差分别为０．０１８和３．５°,独立区内二个分子的Ａ链Ｎ端Ａｌ－丙氨酸残基清晰可见。     

RP-HPLC法测定工程菌发酵液中的乙酸含量

随着基因工程的发展,工程菌发酵工艺越来越受到重视,工程菌在含有葡萄糖的培养基发酵过程中,往往有乙酸产生。乙酸的产量与比生长速率有关,乙酸的存在对工程菌的生长及表达物有影响。本文采用了RP-HPLC法,选用简便的样品预处理方法,测定了温度诱导型IL-2工程菌发酵液中的乙酸量,得到了较好的分离效果。发现该菌在培养过程中确有乙酸积累,并在升温诱导后乙酸量急剧增加。 1 材料和方法 1.1 试剂     

MM3工程菌的大规模发酵培养工艺研究

首先在50L发酵罐上研究了MM3工程菌的发酵培养工艺。确定了接种量、搅拌转速、pH和补料速率等参数,活菌数可达每毫升211亿。以溶氧为放大准则可成功地将该工艺在200L国产发酵罐上再现。说明该工艺具有可放大性,可在全国各药厂推广应用。