嘌呤核苷磷酸化酶与嘧啶核苷磷酸化酶的融合表达及酶法合成嘌呤核苷类产物

将嘌呤核苷磷酸化酶与嘧啶核苷磷酸化酶进行融合,提高生物酶法催化合成克拉屈滨等嘌呤核苷类产物的产率.设计不同的刚性、柔性连接短肽(Linker),将嘧啶核苷磷酸化酶EcUP与嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP连接融合,考察酶融合蛋白的可溶性表达与活性情况.使用EEEEEEKKK短肽连接的融合蛋白EcUP-L4-AmPNP可溶性表...     

灵芝-黄芪双向发酵菌质多糖的分离纯化及生物活性研究

本文旨在探究灵芝-黄芪双向固体发酵体系对灵芝多糖生物活性的增效作用。分别以灵芝-黄芪双向发酵菌质和未添加黄芪的灵芝菌发酵菌质为原材料提取多糖,采用热水浸提和离子交换色谱对粗多糖进行分离,得到PG-1和PG-2,添加黄芪发酵的菌质多糖中的PG-1组分相较于未添加黄芪发酵的菌质多糖中的PG-2组分增加了325%的产量。对PG-1和PG-2进行初步的结构鉴定和免疫活性、抗肿瘤活性的研究。运用排阻色谱法测定其分子量,高效液相色谱、紫外光谱和红外光谱等方法分析其单糖组成、官能团、糖苷键构型以及糖分子链链型。PG-1和PG-2都由葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖4种组成,单糖组分摩尔比分别为12∶58∶21∶9和16∶41∶32∶11。分子量分别为9.2×10~4和8.9×10~4。PG-1和PG-2均由β-糖苷键连接,二者糖链间有—O—连接。PG-1和PG-2均是具有三螺旋空间构象的分子量相对均一的多糖。体外细胞实验结果显示:加入PG-1和PG-2后,巨噬细胞的增殖作用、巨噬细胞对中性红的吞噬作用、巨噬细胞的保护作用和对肿瘤细胞增殖的抑制作用都显著地提高。在细胞实验中,PG-1显示出比PG-2更强的免疫增强活性和对肿瘤细胞增殖的抑制作用,说明添加黄芪促进了灵芝菌质多糖的分泌,使灵芝多糖的免疫增强活性和抗肿瘤活性增强。     

大肠杆菌BL21(DE3)膜组分相关基因的敲除对重组蛋白胞外分泌的影响

摘要:【目的】探究Escherichia coli BL21(DE3)中膜组分相关的脂多糖合成基因waaF或msbB的敲除对重组蛋白胞外分泌的影响。【方法】运用Red重组技术将E.coli BL21 (DE3)染色体上的基因waaF或msbB敲除,构建敲除菌株E.coli BL21(ΔwaaF)、E.coli BL21(ΔmsbB)。将本实验室保存的带有β-呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidase,β-FFase)、青霉素G 酰化酶(penicillin G acylase,PGA)基因的重组质粒pET-ffase、pET-pga分别转入敲除菌株及出发菌株中,构建工程菌株E.coli BL21(ΔmsbB)/pET-ffase、E.coli BL21(ΔwaaF)/pET-ffase、E.coli BL21(DE3)/pET-ffase、E.coli BL21(ΔmsbB)/pET-pga、E.coli BL21(ΔwaaF)/pET-pga、E.coli BL21(DE3)/pET-pga。最后通过摇瓶发酵研究敲除菌株对β-FFase、PGA胞外分泌的影响。【结果】当诱导表达4 h,以出发菌株E.coli BL21(DE3)为宿主时,β-呋喃果糖苷酶β-FFase的胞外分泌量占总表达量的2.6%,以敲除菌株ΔmsbB为宿主时,胞外分泌量达到19.7%,而以敲除菌株ΔwaaF为宿主时,胞外分泌量达到50.9%。另外,当诱导表达24 h,以敲除菌株ΔwaaF为宿主时,青霉素G酰化酶PGA的胞外酶活是出发菌株中的4.1倍,达到1708 U/L。【结论】本研究成功构建了敲除菌株ΔmsbB和ΔwaaF,ΔmsbB能明显增强β-FFase的胞外分泌,而ΔwaaF对β-FFase和PGA的胞外分泌均有显著的强化作用。