远交系小鼠胚胎干细胞系的建立及嵌合鼠的获得

ＥＳ细胞（ＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌｓ）是来源于小鼠早期胚胎的多潜能干细胞,它可以在体外大量培养。并以单细胞的形式注射到早期胚胎里,发育为嵌合体。到目前为止,通常使用的１２９小鼠品系是来源于近交系（ｉｎｂｒｅｄ）小鼠的胚胎．与之相比,远交系小鼠应当具有较强的生命力和抗病能力。曾有人报道过建成了远交系小鼠胚胎干细胞系,但是尚没有见到获得嵌合鼠的报道。有人甚至认为：由于不同品系小鼠所具有的遗传背景不同,有的小鼠不能建成ＥＳ细胞系。最近,本实验室在这方面做了有益的探索,成功地建成了远交系小鼠胚胎干细胞系,并在这里报导首例用远交系小鼠胚胎干细胞系培育成功嵌合体小鼠。采用源于Ｓｗｉｓｓ小鼠远交群的昆明（ＫＭ）品系小鼠囊胚建成了三个小鼠胚胎干细胞系（ＫＥ１．ＫＥ２．ＫＥ５）。核型正常率均达到７０％以上。自第八代起分批冻存,复苏后,培养至第１２代,消化成单细胞,通过囊胚显微注射,将其注射到６１５品系小鼠胚胎。在幸存的幼鼠中获得了一只来源于ＫＥ１细胞的嵌合鼠（Ｔａｂｌｅ１）．其毛色表现为受体鼠（６１５）的白色中嵌合有供体鼠（ＫＭ）的黑褐色（ＰｌａｔｅＩ－Ａ）．嵌合鼠与受体鼠的杂交后代鼠中仍然出现了受体鼠的毛色类型（     

HDC细胞与MESPU-13细胞形成嵌合鼠能力的比较研究

ES细胞嵌合能力的强弱是人们利用ES细胞获得转基因小鼠时十分关心的问题。本文通过囊胚显微注射法将15个左右ES细胞注入C57 BL/6 J品系小鼠3.5天囊胚的囊胚腔中观察嵌合鼠毛色嵌合情况,统计嵌合鼠的出生率;以及用葡萄糖磷酸异构酶(GPI)电泳法检测ES细胞在嵌含鼠体内各种组织和器官的嵌合情况,对于HPRT缺陷(HDC)细胞和MES-PU-13细胞的嵌合能力我们作了较详细的研究,结果表明MESPU-13细胞嵌合能力较强,而HDC细胞嵌合能力较弱,并讨论分析了这种结果的原因。     

pINC—lacZ逆转录病毒载体的构建及其在小鼠胚胎干细胞中的表达

小鼠胚胎干细胞系（ES）是从囊胚的内细胞团中建立起来的多潜能胚胎干细胞系。ES细胞系目前正广泛用于将基因打靶后后的突变和其它遗传变化导入小鼠的种系中。其中,嵌合鼠的获得是非常必要的一步。这就需要用一个可以广泛表达的基因对ES细胞进行标记。大肠杆菌β－半乳糖苷酶（β－gal）基因的表达在细胞水平就能很容易地观察到,而且对哺乳动物细胞没有任何毒害作用,因而是一个被广泛地用于各种细胞基因表达研究中的报导基因。猿类巨细胞病毒早期（SiCMVIE）启动子是一个广泛用于转基因小鼠研究中的强启动子。然而,该启动子在ES细胞方面的报道尚未见到。本研究用BamHI和HindIII双酶切,从psv-β-galactosidasec中得到3．7Kb的lacZ基因片断,将其插入妻pINC载体上（Fig.1) ,得到pINC－lacZ(Fig.2)。用NotI线性化pINC－lacZ后,电击导入MESPU－13细胞中。MESPU－13为本实验室从129／Tcr品系小鼠的囊胚中建立的一个ES细胞系。转化细胞在含有250μg/mlG418的培养基上培养两周,进行MESPU－13细胞稳定转化子的筛选。在一次转化实验中,佾1×10^7个转化的MESPU－13细胞中获得了4个G418抗性克隆。X－gal染色表明：其中3个克隆中有导入的基因表达。由于其中的一个细胞系MC15表现阳性染色（Fig.3)和很好的生长状态,对该系进行了进一步的研究。MC15细胞的二倍体核型正常率为72．4％。MESPU－13细胞不表现β－gal活性;另外,以lacZ基因为探针,对经过BamHI酶切过的MC15细胞基因组DNA进行的Southern分析显示：MC15细胞克隆中仅有一条要交带（Fig.4)。说明该细胞克隆中含有一个单考贝整合。在谱系分析中成功的细胞标记依赖于标记基因的稳定表达。许多强的启动子被用于基因表达的研究。例如鸡的β－肌动蛋白启动子。外源基因可以稳定地整合到未分化细胞的染色体上,然而它们的表达常常被抑制直到随后的分化过程中。本研究中我们首次用强的SiCMVIE启动子构建了pINC－lac载体,由SiCMVIE启动子引导转录的lacZ基因能够在ES细胞中表达。然而lacZ的表达仅存在于3个克隆中,另一个克隆并不表现β－gal活性。很可能在不同整合位为上基因的表达是不同的。     

肿瘤浸润性γδT细胞（γδTIL）CDR3δ1区的序列分析

目的对肿瘤浸润性γδT细胞（γδTIL）CDR3δ1区进行序列分析。方法用固相包被抗体,体外扩增14例肿瘤组织（胃癌、肾癌、卵巢癌、膀胱癌、食管癌、肺癌、嗜铬细胞瘤）和2例肿瘤腹水（浆乳癌）的γδ肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltration lymphocytes,γδTIL）,RT-PCR法扩增CDR3δ1基因片段,测序分析其序列特征。结果 16例γδTIL的CDR3δ1确实存在优势序列,不完全相同。其中4例胃癌来源的γδTIL中3例的CDR3δ1优势序列相同,3例食管癌来源的γδTIL中2例的CDR3δ1优势序列相同。结论体外扩增培养的γδTIL的TCR CDR3δ1序列具有相对优势特征。不同个体的同种组织来源的γδTIL的CDR3δ1优势序列趋于相同。     

PDAPP转基因小鼠脑组织内反应性星形胶质细胞的活化程度明显升高

目的　研究PDAPP转基因小鼠脑组织内反应性星形胶质细胞的活化程度。方法　通过免疫组织化学染色方法检测小鼠脑组织内反应性星形胶质细胞表达胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)的情况 ,比较PDAPP转基因小鼠和C5 7 BL非转基因小鼠脑组织反应性星形胶质细胞的活化程度。结果　PDAPP转基因小鼠脑组织内反应性星形胶质细胞表达GFAP的水平明显高于C5 7 BL非转基因小鼠。结论　PDAPP转基因小鼠脑组织内存在明显的神经炎症反应     

Studies on Two Factors Affecting the Production of Germline Chimeras by Using HM 1 Cells

ＥＳ细胞系统与基因定位致变相结合,进行基因敲除（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）已成为研究基因在生物体内功能的重要手段。在ＥＳ细胞系的建立、外源基因导入ＥＳ细胞、种系嵌合鼠的获得等三个重要环节中,种系嵌合鼠的获得是最关键的一环。由于ＥＳ细胞系统技术复杂、实验条件要求很高,尽管国际上已报导了上百例的基因敲除（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）实验,但是到目前为止,我国还无一例在国内条件下获得种系嵌合鼠的正式报道。本研究对影响种系嵌合鼠获得的两种因素（饲养层细胞、受体胚胎种类）进行了比较研究,成功地获得了种系嵌合鼠。将ＨＭ１细胞在ＳＴＯ或ＭＥＦ培养层上培养至２１３３代,注射到不同小鼠的囊胚里,经过恢复培养,移植到假孕的昆明白雌鼠子宫内。由于ＨＭ１细胞来源于粟色的的１２９品系,而胚胎供体鼠的毛色为黑或白色,仔鼠出生一周后即可辨别是否为毛色嵌合鼠。用成年嵌合鼠与其受体胚胎相同品系的小鼠交配,进行种系嵌合鼠鉴定。曾有报导：ＳＴＯ培养层会导致ＥＳ细胞发生核变。我们改用ＭＥＦ培养层,获得嵌合鼠的比率高达４８．６％（Ｔａｂｌｅ１）。不同小鼠胚胎之间存在差异,Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、ＩＣＲ和昆明白三者提供的受体胚胎产生嵌合鼠的比率分别为７１．４％、５５％     

广泛用于基因表达调控研究中的LacZ基因

ＬａｃＺ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因,１９６９年,美国哈佛大学以Ｂｅｃｋｗｉｔｈ博士为首的研究小组,应用ＤＮＡ分子杂交技术首次分离到该基因。ＬａｃＺ基因编码的ｂｅｔａ－半乳糖苷酶（简称ｂｅｔａ－ｇａｌ）是由４个亚基组成的四聚体,可催化乳糖的水...     

HDC细胞与MESPU—13细胞形成嵌合鼠能力的比较研究

ＥＳ细胞嵌合能力的强弱是人们利用ＥＳ细胞获得转基因小鼠时十分关心的问题。本言语通过囊胚显微注射法将１５个左右ＥＳ细胞注入Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ品系小鼠３．５天囊胚的囊胚腔中观察嵌合鼠毛色嵌合情况。统计嵌合鼠的出生率;以及用葡萄糖磷酸异构酶（ＧＰＩ）电泳地检测ＥＳ细胞在嵌合鼠体内各种组织和器官的嵌合情况,对于ＨＰＲＴ缺陷（ＨＤＣ）细胞和ＭＥＳＰＵ－１３细胞的嵌合能力我们作了较详细的研究,结果表明ＭＥＳＰＵ